劉平平，虞旦，王昌濤，2，趙丹，張佳嬋，李萌，*

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院植物資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.北京工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

三七是五加科植物Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的根，《本草綱目拾遺》中記載：“人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同而功亦等，故稱(chēng)人參三七，為中藥中之最珍貴者”[1]。據(jù)書(shū)中記載，三七功用補(bǔ)血，能夠活血達(dá)到去瘀生新的效果，外用能夠消腫鎮(zhèn)痛；其抗炎癥的作用以及免疫調(diào)節(jié)的作用非常顯著，不僅能抑制疤痕增生，還能起到抗衰老、抗氧化作用[2-4]。此外，現(xiàn)代藥理研究也證明三七中的主要有效成分之一皂苷對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的抑制作用和鎮(zhèn)痛作用[5]，尤其是人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 還具有增強(qiáng)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，減緩衰老的功效，并具有顯著抗纖維化作用，外用可保養(yǎng)皮膚[6-8]；此外，大量關(guān)于三七多糖生理活性的研究表明，三七多糖具有促進(jìn)加強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能[9]，還可以抵抗微波轄射[10]、提高免疫力[11]，有骨缺損修復(fù)和促進(jìn)恢復(fù)創(chuàng)傷等作用[12]。

現(xiàn)有研究中對(duì)多糖的提取常用的方法包含水提、堿提、酸提、苯酚提取、微波輔助提取、超聲輔助提取和酶提等方法[13]。其中微生物發(fā)酵法可利用代謝途徑分泌出的各種生物酶，分解植物細(xì)胞的致密結(jié)構(gòu)，使植物活性成分順利提取出來(lái)。且在發(fā)酵過(guò)程中，微生物自身代謝將許多人體不能直接吸收利用的有效活性物質(zhì)大分子降解成小分子，從而使發(fā)酵產(chǎn)物在人體中可以更快地被吸收，有提高有效成分利用率、產(chǎn)生新化合物、減少毒副作用、提高提取率的功效[14]。

皮膚角質(zhì)細(xì)胞能夠合成多種促炎因子和半抗原，在皮膚受到刺激時(shí)，在免疫自穩(wěn)及免疫應(yīng)答過(guò)程中，發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)采用食用級(jí)黃酒酵母發(fā)酵的方法提取三七多糖，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，檢測(cè)三七多糖對(duì)人類(lèi)永生化表皮細(xì)胞HacaT 培養(yǎng)體系中這些細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，從而對(duì)三七多糖的抗炎功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七粉：云南白藥集團(tuán)股份有限公司；黃酒酵母：植物資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；酵母浸粉（生物試劑）、瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)；葡萄糖（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)；濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇（分析純）：北京化工廠；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；0.05%（含乙二胺四乙酸）胰蛋白酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清：美國(guó)GIBCO 生命技術(shù)公司；噻唑藍(lán)溴化四唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）：美國(guó) Sigma 公司；人表皮永生化細(xì)胞（HacaT）：中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒（DP430）、FastKingRTKit（WithgDNase）（KR116）、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑彩色版（FP215）：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；全溫度震蕩培養(yǎng)箱DQHZ-2001A：太倉(cāng)華美生化儀器廠；UVmini－1240 紫外分光光度計(jì)：日本島津；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；Sunrise 酶標(biāo)儀：帝肯貿(mào)易有限公司；倒置顯微鏡：株式會(huì)社尼康；Bss160 帶自動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)的孵化箱Grumbach；ZEISS 體式顯微鏡：ZEISS；DJW-5KVA 智能型交流凈化穩(wěn)壓電源：北京力能恒電電子科技有限公司；ABI7300 型熒光定量PCR 儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[15]，首先是標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?？偺琴|(zhì)量濃度（ρ）在0～0.12 g/L 范圍內(nèi)與A490呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)方程為：A490=10.213ρ-0.048（R2=0.999 3）。

樣品含量測(cè)定：將水溶性多糖樣品稀釋至合適濃度后，加1 mL 置于試管中，取兩只帶塞試管，分別吸取1 mL 待測(cè)液和1 mL 去離子水，再分別依次添加0.5 mL 5%苯酚，搖勻后加入2.5 mL 濃硫酸，蓋上試管蓋，充分搖勻，靜置5 min；沸水浴1h，測(cè)定吸光值A(chǔ)490。

1.3.2 還原糖含量測(cè)定

采用DNS 法測(cè)定還原糖糖含量[16]，首先是標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。還原糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（ρ）在0～0.12 g/L 范圍內(nèi)與A540呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)方程為，標(biāo)曲：A540=0.006 3ρ-0.002 8，R2=0.999。

樣品含量測(cè)定：樣品液適當(dāng)稀釋?zhuān)M量使糖濃度為 0.1 g/L～1.0 g/L，取 1.0 mL 到試管中，加入 DNS 試劑2 mL，沸水浴加熱2 min 后用流水冷卻，再加蒸餾水補(bǔ)足到15 mL 刻度，在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

1.3.4 高效食用級(jí)黃酒酵母的培養(yǎng)

挑取高效食用級(jí)黃酒酵母單菌落接菌于固體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）固體培養(yǎng)基上單菌落接菌于YPD 液體培養(yǎng)基，在28 ℃搖床中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)之后即可作為菌種備用。

1.3.5 微生物發(fā)酵法提取三七多糖單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 液料比單因素試驗(yàn)

選取 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）6 個(gè)梯度作為液料比的單因素試驗(yàn)條件[17]，經(jīng)125 ℃滅菌30 min 后，接種食用級(jí)黃酒酵母，在30 ℃搖床中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min 后取上清液，在100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液。設(shè)置3 組平行。

1.3.5.2 時(shí)間單因素試驗(yàn)

選取 36、42、48、54、60 h 這 5 個(gè)梯度作時(shí)間的單因素試驗(yàn)條件，固定液料比為 40∶1（mL/g），經(jīng) 125 ℃滅菌30 min 后，接種食用級(jí)黃酒酵母，在30 ℃搖床中培養(yǎng)不同時(shí)間后，轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min后取上清液，在100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液。設(shè)置3 組平行。

1.3.5.3 溫度單因素試驗(yàn)

選取 26、28、30、32、34 ℃這 5 個(gè)梯度作溫度的單因素試驗(yàn)條件[18]，固定液料比為 40∶1（mL/g），經(jīng) 125 ℃滅菌30 min 后，接種食用級(jí)黃酒酵母，在不同溫度搖床中培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min后取上清液，在100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液。設(shè)置3 組平行。

1.3.5.4 接菌量單因素試驗(yàn)

選取不同接菌量3%、4%、5%、6%、7%這5 個(gè)梯度作為單因素試驗(yàn)條件，固定液料比為40∶1（mL/g），經(jīng)125 ℃滅菌30 min 后，接種不同量食用級(jí)黃酒酵母，在30 ℃搖床中培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min 后取上清液，在100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液。設(shè)置3 組平行。

1.3.6 三七多糖提取得率

三七多糖提取得率/（g/g）=多糖含量×發(fā)酵液體積/三七質(zhì)量

1.3.7 微生物發(fā)酵法提取三七多糖正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的3 個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，選取液料比、溫度、接菌量，每個(gè)因素各取3 個(gè)水平，以發(fā)酵液中三七多糖的提取得率為考察指標(biāo)。

其他試驗(yàn)條件確定為：pH 值為7，發(fā)酵時(shí)間36 h，按照正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵后將溶液在轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min 后取上清液，在100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液測(cè)多糖含量。設(shè)置3 組平行，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment design

1.3.8 三七發(fā)酵液多糖制備

于三七懸浮液中接種3%食用級(jí)黃酒酵母，30 ℃搖床中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速4 800 r/min 離心發(fā)酵液20 min后取上清液，100 ℃水浴滅菌20 min，混合均勻后得三七發(fā)酵液，醇沉三七發(fā)酵液，凍干得到多糖粉末，多糖溶解后以酶解與Sveag 法結(jié)合的方法多次去蛋白，懸蒸去除有機(jī)試劑，再次凍干得到三七發(fā)酵液多糖（三七多糖）。

1.3.9 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.9.1 細(xì)胞復(fù)蘇

從-80 ℃冰箱中取出待用凍存的HacaT 細(xì)胞，迅速37 ℃水浴，在1 min～2 min 內(nèi)輕微振動(dòng)將其融化。1 000 r/min 離心10 min，去上清。加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至10 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃5%CO2培養(yǎng)。

1.3.9.2 細(xì)胞傳代

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用2 mL 磷酸緩沖鹽溶液洗兩次（動(dòng)作輕柔）。加入200 μL 0.25%的胰酶放入CO2培養(yǎng)箱中消化5 min，放到顯微鏡下觀察，當(dāng)確認(rèn)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落后，加入2 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，800 r/min 離心10 min，去上清，加入4 mL培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)后，以5×105密度接種于10 cm2培養(yǎng)瓶。

1.3.9.3 MTT 法測(cè)定HacaT 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的HacaT 細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶將HacaT 細(xì)胞消化，離心后重懸于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)；用96 孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照，邊緣孔用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液填充，在5%CO2，37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)過(guò)夜；按照各自終濃度分別加入三七多糖，細(xì)胞對(duì)照組是未做處理的組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后加入5 g/L 的MTT溶液，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)；吸除孔內(nèi)液體，用磷酸鹽緩沖液洗滌1 次，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解結(jié)晶；M3 讀板儀測(cè)定各孔吸光度值 A570。分別用 0.5、1、2、2.5、5 g/L三七多糖和100 μmol/L 阿司匹林各5 μL 添加到5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，處理HacaT 細(xì)胞24 h。提取細(xì)胞總RNA，熒光定量分析炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，以ERK1 作為內(nèi)參基因。

1.3.9.4 三七多糖溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間培養(yǎng)

將消化后的細(xì)胞，以2×106/孔的密度接種6 孔板內(nèi)，以 0.5 g/L 濃度三七多糖處理細(xì)胞 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h[19]。提取細(xì)胞總RNA，熒光定量分析處理對(duì)炎癥細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響，以ERK1 作為內(nèi)參基因。

1.3.10 細(xì)胞總RNA 提取與轉(zhuǎn)錄

按照RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.11 引物及探針的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)NCBI 中發(fā)布的基因序列，通過(guò)Primer Express 軟件設(shè)計(jì)出13 個(gè)基因（包含管家基因ERK1）的特異性引物，引物序列見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for real-time PCR

1.3.12 實(shí)時(shí)熒光PCR

根據(jù)SuperReal 熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，總反應(yīng)體系為 20 μL，包括 cDNA 模板 1 μL，10×Super－Real PreMix Plus 緩沖液 10 μL，正、反義引物各 0.3 μL，熱啟動(dòng)酶 0.25 μL，雙蒸水補(bǔ)足至 20 μL。

循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 2 min，然后按 95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，72 ℃收集熒光數(shù)據(jù)。反應(yīng)在ABI7300 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵法提取三七多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)三七多糖提取的影響

不同液料比對(duì)三七多糖提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取液料比對(duì)三七多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the polysaccharides content

如圖1 所示，三七多糖提取得率隨著液料比的增加而增加，在液料比為50∶1 （mL/g）時(shí)達(dá)到了峰值0.476 g/g，隨后提取得率隨著液料比的升高而降低。說(shuō)明溶劑液料比在一定范圍內(nèi)對(duì)提取得率有顯著的影響。因此，選擇 40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）作為正交試驗(yàn)水平。

2.1.2 時(shí)間對(duì)三七多糖提取的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七多糖提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)三七多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of time on the polysaccharides content

如圖2 所示，提取得率隨著時(shí)間的增加變化并不明顯，說(shuō)明較短時(shí)間內(nèi)酵母菌已經(jīng)完成了周期性的增長(zhǎng)，消耗大糖轉(zhuǎn)化為小分子糖類(lèi)，總糖含量并無(wú)明顯改變。本著工藝低成本和高提取得率的原則，不將時(shí)間當(dāng)作一個(gè)正交試驗(yàn)因素，在后續(xù)試驗(yàn)中將發(fā)酵時(shí)間定為正常的48 h。

2.1.3 溫度對(duì)三七多糖提取的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)三七多糖提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)三七多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the polysaccharides content

如圖3 所示，提取得率隨著溫度的增加變化率顯著，在溫度為32 ℃時(shí)達(dá)到了峰值0.491 g/g，隨后提取得率隨著溫度的升高而降低，在36 ℃后變化開(kāi)始趨于平緩?？赡苁且欢囟认聲?huì)促進(jìn)三七多糖的溶出，過(guò)高溫度會(huì)影響黃酒酵母的生長(zhǎng)繁殖從而導(dǎo)致提取得率降低，因此，選擇28、32、36 ℃作為正交試驗(yàn)因素。

2.1.4 接菌量對(duì)三七多糖提取的影響

不同接菌量對(duì)三七多糖提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，提取得率隨著接菌量的增加變化率顯著，當(dāng)接菌量5%時(shí)達(dá)到了峰值0.410 g/g，隨后提取得率隨著接菌量的增大而降低，可能是由于菌量達(dá)到飽和狀態(tài)，從而影響生長(zhǎng)4%、5%、6%作為正交試驗(yàn)因素。

圖4 接菌量對(duì)三七多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the polysaccharides content

2.2 發(fā)酵法提取三七多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

不同因素組合對(duì)三七多糖提取的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3 極差分析可知，各因素對(duì)三七多糖提取效果的影響主次分別為：溫度＞液料比＞接菌量，發(fā)酵法提取三七多糖的最佳工藝條件為：液料比為50∶1（mL/g），發(fā)酵溫度為32 ℃，接菌量為5%。通過(guò)觀察極差R 值可看結(jié)果表現(xiàn)出顯著性差異。最后，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)項(xiàng)優(yōu)方案試驗(yàn)，提取的三七多糖提取得率為0.501 g（多糖）/g（原料），符合預(yù)期值。

2.3 對(duì)HacaT細(xì)胞增殖的影響

三七多糖濃度對(duì)HacaT 細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 三七多糖濃度對(duì)HacaT 細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Cell viability with different polysaccharide of Panax notoginseng

如圖5 所示，以未加任何三七多糖的細(xì)胞作空白對(duì)照，當(dāng)三七多糖濃度高達(dá)2 g/L 時(shí)，細(xì)胞增殖活力依然超過(guò)90%，說(shuō)明三七多糖對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性。且當(dāng)三七多糖濃度減小，細(xì)胞增殖活力反而增加，三七多糖濃度為0.5 g/L 和1 g/L 時(shí)，細(xì)胞存活率高達(dá)141.32%和139.25%，說(shuō)明低濃度三七多糖對(duì)HacaT 有增殖作用，在后面試驗(yàn)中以低濃度三七多糖作為作用于HacaT 細(xì)胞的濃度。

2.4 三七多糖處理濃度的確定

以100 μmol/L 阿司匹林作為參照，觀察同一時(shí)間段內(nèi)不同濃度三七多糖處理?xiàng)l件下HacaT 細(xì)胞中的CSF-1 表達(dá)量的差異，以及同一濃度三七多糖不同時(shí)間段處理?xiàng)l件下CSF-1 表達(dá)量的差異。

不同濃度三七多糖對(duì)CSF-1 基因表達(dá)量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同濃度三七多糖對(duì)CSF-1 基因表達(dá)量的影響Fig.6 Influence of different polysaccharide of Panax notoginseng to CSF-1 expression

從圖6 中可以看出，通過(guò)SPSS 軟件進(jìn)行LSD 法和Duncan 法分析其顯著性，相同濃度的三七多糖在不同時(shí)間段的處理下差異顯著（P＜0.05），不同濃度的三七多糖的處理后水平差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇0.5 g/L 的三七多糖為最終濃度，考察其處理不同時(shí)間對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)量的影響。

2.5 三七多糖添加時(shí)間影響

考察時(shí)間效應(yīng)，三七多糖處理HacaT 細(xì)胞，2 h內(nèi)，炎癥相關(guān)基因表達(dá)量變化。

2.5.1 炎癥因子類(lèi)基因（IL-6、IL-8）

促炎癥因子IL-6 在炎癥和免疫反應(yīng)中具有多種功能，是由活化的單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌的，在促炎因子IL-1 和TNF 的刺激下，IL-6 的表達(dá)量會(huì)增加，從而增加炎癥反應(yīng)中花生四烯酸的釋放，刺激T 細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)B 細(xì)胞分泌免疫球蛋白，血清中IL-6 的水平增高幾乎與炎癥程度成正比[20-21]。在炎癥反應(yīng)中，IL-8 是直接作用于表皮細(xì)胞，主要是促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展，聚集并激活T 淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[22]。

三七多糖對(duì)IL-6/IL-8 表達(dá)量的影響見(jiàn)圖7。

圖7 三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)IL-6/IL-8 表達(dá)量影響Fig.7 Influence of training time by polysaccharide of Panax notoginseng to IL-6/IL-8 expression

如圖7 所示，相比于對(duì)照組100 μmol/L 阿司匹林，IL-6 的表達(dá)量更高，到60 min 時(shí)上升到最高，然后緩慢降低，在120 min 的時(shí)間降到初始值附近。整體來(lái)看，三七多糖對(duì)IL-6 基因表達(dá)量的影響主要在2 h 內(nèi)的促進(jìn)作用。三七多糖對(duì)IL-6 基因表達(dá)量的影響驗(yàn)證了三七多糖可能是通過(guò)影響的花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用的。

在30 min 短時(shí)間內(nèi)，IL-8 表達(dá)量迅速上升至最高值，并在接下來(lái)時(shí)間內(nèi)保持下降趨勢(shì)，之后的一個(gè)小時(shí)內(nèi)降到初始值以下，再緊接著從90 min 到120 min的時(shí)間內(nèi)，仍然保持下降趨勢(shì)。整體來(lái)看，三七多糖對(duì)IL-8 基因的影響主要體現(xiàn)在30 min 到120 min 內(nèi)迅速抑制其表達(dá)。IL-8 表達(dá)的增高使得大量中性粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域聚集，通過(guò)釋放炎癥介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。三七多糖先激發(fā)后抑制了IL-8 的表達(dá)，間接地抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)炎癥起到緩解功效。

2.5.2 造血生長(zhǎng)因子（CSF1、CSF2）

CSF1 為造血生長(zhǎng)因子，參與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖分化以及存活[23-24]，CSF2 為具有多效性的造血生長(zhǎng)因子，體內(nèi)研究表明CSF2 的產(chǎn)量與效應(yīng)可以由TNF、MIP-1a 等調(diào)控[25-26]。

三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)CSF-1/CSF-2 表達(dá)量影響見(jiàn)圖8。

圖8 三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)CSF-1/CSF-2 表達(dá)量影響Fig.8 Influence of training time by polysaccharide of Panax notoginseng to CSF-1/CSF-2 expression

根據(jù)圖8 發(fā)現(xiàn)，三七多糖對(duì)CSF-1、CSF-2 的作用主要表現(xiàn)為抑制作用，30 min 短時(shí)間內(nèi)，三七多糖作用于CSF-1 使其表達(dá)量迅速下降，此時(shí)阿司匹林對(duì)照組的表達(dá)量表現(xiàn)為上升且表現(xiàn)為促進(jìn)表達(dá)的作用，之后的一個(gè)小時(shí)內(nèi)，即從30 min 到90 min 的時(shí)間內(nèi)，CSF-1 基因有緩慢的上升趨勢(shì)，增幅不大且表達(dá)量數(shù)值一直小于初始值，在90 min 到120 min 的時(shí)間內(nèi)，又有下降趨勢(shì)。整體來(lái)看，三七多糖對(duì)CSF-1 基因的影響主要體現(xiàn)在0 min 到30 min 內(nèi)迅速抑制其表達(dá)，并在120 min 的時(shí)間內(nèi)保持抑制其表達(dá)的作用，間接地抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。三七多糖作用于CSF-2 的作用趨勢(shì)類(lèi)似，先降低再升高再降低，但是幅度小于CSF-1，而且對(duì)照組阿司匹林作用于CSF-2 的表達(dá)量在前60 min 是低于三七多糖對(duì)CSF-2 的表達(dá)量，在90 min時(shí)短暫反超后又在120 min 時(shí)再次低于，但整體跟三七多糖一樣，對(duì)于CSF-2 的表達(dá)量一直是抑制作用。

2.5.3 趨化因子相關(guān)基因CCL20、白細(xì)胞募集因子CXCL3

CCL20、CXCL3 則是具有能將白細(xì)胞募集到炎癥部位的因子，主要功能是白細(xì)胞募集，在炎癥初期發(fā)揮自體免疫功能，應(yīng)對(duì)感染[27]。

三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)CCL20/CXCL3 表達(dá)量影響見(jiàn)圖9。

圖9 三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)CCL20/CXCL3 表達(dá)量影響Fig.9 Influence of training time by polysaccharide of Panax notoginseng to CCL20/CXCL3 expression

三七多糖對(duì)CCL20/CXCL3 表達(dá)量的影響如圖9所示，相比于對(duì)照組100 μmol/L 阿司匹林，CCL20 的表達(dá)量偏高但是也很接近，從0 min 到60 min，一直緩慢上升到達(dá)最高值，緊接著緩慢降低，在120 min 的時(shí)間降到初始值附近。整體來(lái)看，三七多糖對(duì)CCL20 基因表達(dá)量的影響主要在2 h 內(nèi)的促進(jìn)作用。三七多糖對(duì)CCL20 基因表達(dá)量的影響驗(yàn)證了三七多糖能夠在炎癥發(fā)生時(shí)調(diào)動(dòng)白細(xì)胞發(fā)生免疫。

相比于對(duì)照組 100 μmol/L 阿司匹林，CXCL3 的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，從0 min 到60 min 時(shí)中，快速上升到達(dá)最高值，緊接又急劇降低，在120 min 的時(shí)間降到初始值附近并低于初始值。對(duì)照組阿司匹林對(duì)CXCL3 表達(dá)量也是先增加再降低，但是表達(dá)量增幅不多且在90 min 時(shí)就降至初始表達(dá)量以下。從整體來(lái)看，三七多糖對(duì)CXCL3 基因表達(dá)量的抑制作用體現(xiàn)在90 min 之后，且慢于阿司匹林，三七多糖對(duì)CXCL3 基因表達(dá)量的影響驗(yàn)證了三七多糖能夠在炎癥發(fā)生后期調(diào)動(dòng)白細(xì)胞發(fā)生免疫。

2.5.4 蛋白抗體TNF-AIP3

TNF-AIP3 主要由TNF 誘導(dǎo)表達(dá)，是一個(gè)重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)基因，其過(guò)表達(dá)可阻斷TNF 受體或T 細(xì)胞受體（TCR）引起的NF-kappa 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[28]。

三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)TNF-AIP3 表達(dá)量影響見(jiàn)圖10。

圖10 三七多糖處理不同時(shí)間對(duì)TNF-AIP3 表達(dá)量影響Fig.10 Influence of training time by polysaccharide of Panax notoginseng to TNF-AIP3 expression

根據(jù)圖10 發(fā)現(xiàn)，三七多糖對(duì)TNF-AIP3 的作用主要表現(xiàn)為抑制作用，在120 min 內(nèi)變化幅度不大，但是一直處于抑制表達(dá)的狀態(tài)，說(shuō)明三七多糖對(duì)TNFAIP3 基因的影響主要體現(xiàn)在120 min 的時(shí)間內(nèi)保持抑制其表達(dá)的作用，間接地抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。相比于阿司匹林對(duì)照組，阿司匹林作用細(xì)胞后60 min，TNF-AIP3 的表達(dá)量開(kāi)始上升，在接下來(lái)30 min 短時(shí)間內(nèi)又迅速下降到抑制狀態(tài)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)微生物發(fā)酵法對(duì)三七中的多糖進(jìn)行提取，并采取正交試驗(yàn)對(duì)三七多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)采用熒光定量PCR 方法檢測(cè)三七多糖對(duì)炎癥細(xì)胞因子在2 h 內(nèi)的變化趨勢(shì)。研究結(jié)果表明：經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，選出對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的液料比、溫度、接菌量3 個(gè)因素，并選定3 個(gè)水平為考察指標(biāo)，最終得到最優(yōu)提取工藝為：液料比50∶1（mL/g）、接菌量為5 %、溫度為32 ℃、pH 值為7，發(fā)酵時(shí)間36 h，此時(shí)多糖提取得率最高，達(dá)到0.501 g/g。通過(guò)MTT 法檢測(cè)多糖對(duì)HacaT 細(xì)胞的增殖作用及安全濃度范圍為1 g/L，用0.5 g/L 的三七多糖考察不同時(shí)間處理對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)量的影響：白細(xì)胞活化因子CSF2、CSF1 下調(diào)，胞內(nèi)信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)因子 TNF-AIP3 表達(dá)下調(diào)、Cxcl3、TNFAIP3 基因的表達(dá)均有下調(diào)的作用；對(duì)IL6 是上調(diào)作用，對(duì)CCL20、IL8（CXCL8）是先上調(diào)再抑制。綜上，炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)復(fù)雜多樣，三七多糖可干預(yù)炎癥反應(yīng)不只是通過(guò)某個(gè)基因的方式進(jìn)行的，而是以多基因靶點(diǎn)和多環(huán)節(jié)方式減弱促炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)抗炎癥反應(yīng)，以達(dá)到抗炎功效。