閆旭宇，李玲

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

薏米，又叫薏苡仁，為禾本科植物薏苡（Coix lacryma-jobi L.）的種仁。薏苡是一種營養(yǎng)豐富的糧藥兼用的一年生或多年生植物，其種仁薏米具有較全面的營養(yǎng)成分和特殊的藥用保健功效。薏米多糖的單糖組分較復(fù)雜，包括葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖[1]，是藥理活性較高的物質(zhì)，具有降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫和防治腫瘤[2]等功效。同時(shí)，薏米多糖具有良好的耐熱性能，在100 ℃左右具有較好的穩(wěn)定性[3]；并具有一定的抗氧化性，對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）以及DPPH 自由基具有清除能力[1]。對(duì)薏米多糖提取工藝的已有研究有水提法、超聲或微波輔助提取法[4]、以及亞臨界水萃取法[5]等。超聲波作為一種輔助提取方法，通過增大溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力，加快細(xì)胞破碎的速度，使溶劑快速的滲透到細(xì)胞中，提高有效成分的提取率和純度[6]。基于此，本研究利用超聲輔助水提醇沉法從薏米中提取多糖，通過對(duì)羥自由基的清除能力明確其抗氧化功效，為薏米多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

薏米：市售。

1.1.2 試劑

石油醚、95 %乙醇、無水乙醇、無水乙醚、5 %苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、30%雙氧水、水楊酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器

AUV120 電子分析天平：上海玉博生物科技有限公司；WG-71 鼓風(fēng)干燥機(jī)粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-W600 數(shù)顯三用恒溫水箱：金壇市億通電子有限公司；KQ3200E 超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；R-201 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV2800 紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16G 高速離心機(jī)：湖南省凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；GDYQ-701S 樣品提取儀：長春小天鵝儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薏米多糖提取工藝流程

篩選薏米→粉碎→脫脂→超聲水浴浸提→過濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→濾液醇沉→離心→洗滌→干燥→粗多糖→溶解→待測(cè)液→測(cè)吸光度

關(guān)鍵步驟如下：

1）薏米脫脂：準(zhǔn)確稱取20 g 薏米粉，置于索氏提取器，加石油醚回流（60 ℃）脫脂 2 次，每次 2 h 得到脫脂產(chǎn)物，于3 ℃貯藏備用。

2）超聲水浴浸提：取一定量的脫脂薏米粉，加入蒸餾水，攪拌均勻，超聲提取50 min 后，在電熱恒溫水浴鍋中加熱提取多糖。

3）濾液醇沉：將上清液濃縮至原來的三分之一，再加入3 倍體積的95%乙醇溶液，靜置30 min 后離心（轉(zhuǎn)速為6 500 r/min，時(shí)間為20 min），去上清液，得沉淀物，此沉淀物就是粗多糖。

4）洗滌：依次用無水乙醇、乙醚洗滌2 次，以便破壞水解殘留的脂溶性雜質(zhì)。

1.2.2 測(cè)定多糖含量

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取干燥葡萄糖0.151 g，加蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶中，充分搖勻，得到質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于100 mL 容量瓶中，定容、搖勻。分別吸取各溶液2 mL于試管中，分別加入5%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，用2.0 mL 蒸餾水做空白對(duì)照和調(diào)零，靜置10 min，于60 ℃恒溫水浴10 min 取出，迅速冷卻至室溫20 ℃。在波長為490nm 下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程為Y=0.011 9x+0.010 3，R2=0.993 2。在0～80 μg/mL 范圍內(nèi)，吸光度和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度呈良好的線性關(guān)系。

2）待測(cè)液中多糖的測(cè)定：精確吸取待測(cè)液2 mL 于10 mL 的容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻、靜置。從中吸取2.0 mL 液體至試管中，加入5%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0mL，搖勻。室溫20 ℃靜置10min 后放置60℃恒溫水浴10min 取出，迅速冷卻至室溫20 ℃。在波長為490nm 下測(cè)得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出多糖濃度，求出多糖得率。多糖得率的計(jì)算公式如下：

式中：C 為薏米多糖濃度，mg/mL；V 為稀釋總體積，mL；M 為薏米粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1）料液比的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，水浴加熱溫度為70℃，提取3 h，料液比分別設(shè)置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），平行試驗(yàn) 3 次，研究料液比對(duì)薏米多糖得率的影響。

2）提取溫度的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，體積60 mL，水浴加熱溫度分別設(shè)置為65、70、75、80、85 ℃，提取3 h，平行試驗(yàn)3 次，研究提取溫度對(duì)薏米多糖得率的影響。

3）pH 值的選擇：固定水提取液體積60 mL，水浴加熱溫度為 70 ℃，pH 值分別設(shè)置為 3.5、4、4.5、5、5.5，提取3 h，平行試驗(yàn)3 次，研究pH 值對(duì)薏米多糖得率的影響。

4）提取時(shí)間的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，體積60 mL，水浴加熱溫度為70 ℃，提取時(shí)間分別設(shè)置為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，平行試驗(yàn) 3 次，研究提取時(shí)間對(duì)薏米多糖得率的影響。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比及pH 值為試驗(yàn)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)確定水提醇沉法提取薏米多糖的最佳工藝參數(shù)。

1.2.5 羥基自由基清除試驗(yàn)

薏米多糖及維生素C 對(duì)羥基自由基的清除率，采用水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)羥基自由基的清除率按下式計(jì)算：

式中：E 為羥基自由基的清除率；A0為空白對(duì)照液的吸光值；Am為加入多糖后的吸光值；An為不加H2O2時(shí)多糖的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的料液比對(duì)薏米多糖得率的影響如圖1 所示。

圖1 料液比對(duì)薏米多糖得率的影響Fig.1 Effect of the solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖1 可知，隨著液體量的增加，薏米多糖得率逐漸提高，當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，薏米多糖得率達(dá)到最高，之后下降。這可能是由于一定比例的料液比已經(jīng)使溶出的多糖量達(dá)到平衡，繼續(xù)增大料液比，可能使其他物質(zhì)溶出，多糖的相對(duì)得率就降低了。另外，料液比過大會(huì)增加溶劑的用量，本著節(jié)約成本的原則，料液比為 1∶25（g/mL）左右為宜。

2.1.2 提取溫度的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的提取溫度對(duì)薏米多糖得率的影響如圖2 所示。

圖2 溫度對(duì)薏米多糖得率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖2 可知，隨著提取溫度升高，薏米多糖得率不斷增加，在75 ℃時(shí)，薏米多糖得率最高，之后緩慢下降。這可能是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，多糖更容易浸出，但是過高的溫度易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而造成多糖含量降低。因此，提取溫度應(yīng)控制在75 ℃左右為宜。

2.1.3 pH 值的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的pH 值對(duì)薏米多糖得率的影響如圖3 所示。

圖3 pH 值對(duì)薏米多糖得率的影響Fig.3 Effect of the pH value on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖3 可知，薏米的多糖得率隨著pH 值的升高而增大，pH 值為4 時(shí)多糖得率達(dá)到最大，繼續(xù)升高pH值多糖得率開始降低，但在pH 值為4.5 和5 時(shí)降低幅度不明顯。這可能是由于pH 值為4～5 時(shí)，有利于多糖最大程度的溶出，繼續(xù)升高pH 值會(huì)影響多糖的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此，pH 值應(yīng)控制在4～5 之間。

2.1.4 提取時(shí)間的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的提取時(shí)間對(duì)薏米多糖得率的影響如圖4 所示。

圖4 時(shí)間對(duì)薏米多糖得率的影響Fig.4 Effect of the extraction time on polysaccharide extraction rate in adlay

如圖4 所示，隨著提取時(shí)間增加，薏米多糖得率不斷增加，在提取時(shí)間為1.5 h 時(shí)，薏米多糖得率最高，之后逐漸下降。這可能是由于提取時(shí)間過短，多糖還沒有充分溶出，時(shí)間過長又使其他物質(zhì)的溶出，影響多糖的浸出影響，或多糖提取物中的結(jié)構(gòu)分被破壞。因此，提取時(shí)間選擇1.5 h 左右為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取溫度、pH值、提取時(shí)間為考察因素，以多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2 的極差值大小可知，影響薏米多糖得率的主次因素依次為料液比（A）＞pH 值（C）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（B），料液比對(duì)多糖得率的影響相對(duì)較大。超聲輔助水提醇沉法提取薏米多糖的最佳組合為A2B2C3D3，即料液比為 1∶20（g/mL），提取溫度 75 ℃，pH值為5.0，提取時(shí)間為2 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到薏米多糖得率為1.56%。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal test for optimal conditions

2.3 薏米多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

植物多糖對(duì)羥基自由基有一定清除作用。薏米多糖羥基自由基的清除作用對(duì)如圖5 所示。

圖5 薏米多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.5 The hydroxy radical scavenging rate of the polysaccharide extracted from adlay

由圖5 可知，在一定范圍內(nèi)，薏米多糖提取物和維生素C 對(duì)羥基自由基清除率均逐漸增強(qiáng)，說明多糖提取物和維生素C 對(duì)羥基自由基的清除能力存在著一定的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，薏米多糖提取物對(duì)羥基自由基具有一定的清除作用，但效果弱于維生素C。

3 討論與結(jié)論

多糖廣泛存在于植物體內(nèi)，具有較高的藥理活性。水提醇沉法目前在植物活性多糖提取中應(yīng)用最多，利用該法提取黃精多糖肽得率為0.34%[7]，提取山苦茶[8]、苦瓜[9]、蘆竹[10]及向日葵莖芯[11]等多糖得率分別為1.012%、3.12%、4.80%和6.56%?？梢?，不同的植物利用水提醇沉法提取多糖得率差別較大。利用超聲波輔助提取，多糖的浸提過程和活性不發(fā)生改變，浸提時(shí)間縮短，可以提高提取效率。本試驗(yàn)在超聲輔助水提醇沉法的最優(yōu)條件下，即提取時(shí)間為2 h，提取溫度為 75 ℃，pH 值為 5，料液比為 1∶20（g/mL）時(shí)，薏米多糖得率為1.56%，高于刑真等[12]利用熱水浸提法提取薏米多糖的提取率1.25%以及利用超聲波輔助提取薏米多糖的提取率1.41%。綜合考慮時(shí)間和能耗因素，超聲波輔助水提醇沉法適宜于在省時(shí)節(jié)能的情況下提取薏米多糖。

羥基自由基能破壞細(xì)胞膜、殺死機(jī)體紅細(xì)胞、誘導(dǎo)基因突變、誘發(fā)多種疾病，進(jìn)而引起生命發(fā)生系統(tǒng)性的紊亂。研制價(jià)格低廉經(jīng)濟(jì)有效的抗氧化劑是對(duì)抗羥基自由基的有效途徑。研究表明，羊肚菌[13]、別克參[14]、玫瑰茄[15]等的多糖均具有一定的抗氧化能力。本試驗(yàn)中，在相同質(zhì)量濃度下，薏米多糖提取物對(duì)羥基自由基具有一定的清除作用，但效果弱于維生素C。因此，加強(qiáng)薏米活性成分研究，擴(kuò)大薏米資源的開發(fā)利用，有助于進(jìn)一步推動(dòng)薏米產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。