馮 鑫，蘇現(xiàn)波，馬明思，馬 良，戴宏杰，余 永，郭 婷，周鴻媛，張宇昊,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056005）

近年來，我國兔肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的40%[1]。兔皮是兔肉加工副產(chǎn)物，也是制備明膠的優(yōu)質(zhì)資源。傳統(tǒng)的豬、牛源明膠具有良好的凝膠特性，但因疫病和宗教等原因使用受到很大限制；水產(chǎn)明膠在宗教和疫病方面不受限制，但因其亞基氨基酸含量偏低，導(dǎo)致凝膠特性較差，無法被廣泛應(yīng)用。本課題組前期研究表明，兔皮明膠的凝膠特性、起泡性、乳化性、成膜性等功能特性均不遜于豬皮明膠[2-7]，且沒有疫病威脅，宗教限制程度也遠低于傳統(tǒng)的豬、牛源明膠。因此，具有良好的應(yīng)用前景。

此外，兔皮用于制備明膠的最大優(yōu)勢在于兔皮可經(jīng)稀酸處理后快速實現(xiàn)明膠化。Yu Wei等[8]以兔皮為原料提取明膠，結(jié)果表明質(zhì)量分數(shù)為1%的鹽酸處理10 min可制得較高得率和凝膠強度的兔皮明膠；Ma Mingsi等[9]對兔皮膠原快速明膠化的機理進行了初步研究，結(jié)果表明，在酸處理過程中，兔皮膠原纖維中的共價交聯(lián)可在短時間內(nèi)被破壞，進一步延長酸處理時間則會造成膠原中亞基組分的降解，使后續(xù)清洗過程中損失率提高，進而降低明膠的得率和凝膠特性。此外，隨著酸處理的進行，兔皮膠原中氫鍵被破壞，并在酸處理1 h后形成新的平衡，此時明膠化已經(jīng)完成。該研究初步明確了兔皮快速明膠化的機理，但在明膠化過程中兔皮膠原分子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律方面并未得出明確結(jié)論。

分子模擬又稱“計算機模擬”或“計算機實驗”，是一種根據(jù)實際體系在計算機上進行的實驗，通過比較模擬結(jié)果與實際體系的實驗數(shù)據(jù)來檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，并可檢驗由模型導(dǎo)出的解析理論所作的簡化近似是否成功[10-12]。目前分子模擬技術(shù)已發(fā)展成為生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)和實驗科學(xué)等領(lǐng)域中一種重要的研究工具[13-15]。通過分子模擬可建立多肽、蛋白質(zhì)分子的初始模型，也可顯示已被測定的蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，幫助和促進蛋白質(zhì)肽鏈折疊和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測、總結(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律、揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系[16-20]。最初分子模擬的應(yīng)用主要集中在分子生物學(xué)以及化學(xué)領(lǐng)域，在食品研究領(lǐng)域的應(yīng)用較少，其主要原因在于多數(shù)食品蛋白并不像β-乳球蛋白具備完全解析的結(jié)構(gòu)模型[21-23]。但隨著蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷完善和同源建模預(yù)測技術(shù)的不斷發(fā)展，使得以已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為模板，通過對比蛋白的一級序列來篩選和預(yù)測未知蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)成為可能[24-26]。目前在蛋白數(shù)據(jù)庫中，并無完全解析的膠原蛋白模型，但在數(shù)據(jù)庫中能夠檢索到兔皮膠原較為完整的氨基酸序列，為膠原蛋白模型的構(gòu)建提供了依據(jù)。

因此，本研究在實驗室前期兔皮膠原快速明膠化的基礎(chǔ)上，依據(jù)檢索到的兔皮膠原一級序列，采用分子模擬技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的模型結(jié)構(gòu)，依據(jù)實際實驗調(diào)整設(shè)置酸處理環(huán)境，模擬兔皮明膠化過程，以期全面解析兔皮膠原明膠化過程中膠原的結(jié)構(gòu)變化，為實現(xiàn)兔皮明膠的科學(xué)、高效制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 模型構(gòu)建

通過Uniprot（https://www.uniprot.org/）查找兔皮I型膠原α1鏈和α2鏈氨基酸序列，并以此作為建模的依據(jù)。

非螺旋區(qū)域：膠原蛋白的非螺旋區(qū)模板通過NCBI BLAST進行檢索，選擇E-value得分以及比對結(jié)構(gòu)得分（total score）較優(yōu)的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)。通過YASARA軟件對膠原蛋白三維結(jié)構(gòu)進行同源建模。

三螺旋區(qū)域：三螺旋結(jié)構(gòu)具有典型性，可采用CCBuilder Mk.2軟件直接進行模型構(gòu)建。

1.2 模型評價

分別用PROCHECK和ERRAT程序?qū)?yōu)化后模型蛋白結(jié)構(gòu)進行評價。

1.3 單體系動力學(xué)模擬

以YASARA動力學(xué)軟件對膠原蛋白進行動力學(xué)模擬，使用AMBER14力場，體系壓力為1×106Pa、溶劑密度為0.997 g/L、pH值為1.02、模擬溫度為25 ℃。I型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)通過CC Builder Mk.2軟件構(gòu)建，非螺旋肽結(jié)構(gòu)來自于同源建模結(jié)果。確定模擬體系的溫度耦合采用“Berendsen thermostat”法，壓力耦合采用“manometer”方法，參照壓力為3×107Pa。采用標準立方盒包裹模型及其他分子，復(fù)合物置于盒子中心，盒子設(shè)置成周期循環(huán)，并添加抗衡離子（Na＋和Cl－）固定蛋白，使用最陡下降法對溶劑進行能量優(yōu)化，然后再用局部最陡下降法消除原子間的碰撞；隨后限制蛋白主鏈，使用最陡下降法對溶劑進行能量優(yōu)化，然后再用局部最陡下降法消除原子間的碰撞；每100 ps保存一個軌跡。

上述方式進行模擬體系中的遠程范德華力作用距離取0.8 nm，經(jīng)典相互作用使用球型截斷半徑“cut-off”方法計算。使用YASARA軟件包的動力學(xué)腳本（md_run.mcr）進行動力學(xué)模擬。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析處理采用YASARA和Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型構(gòu)建

膠原蛋白具有三螺旋區(qū)域和兩端非螺旋區(qū)域，對2 個區(qū)域分別進行建模，結(jié)果如圖1所示。

圖1 膠原蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic three-dimensional structure of collagen

2.1.1 非螺旋區(qū)模型構(gòu)建

通過NCBI BLAST對非螺旋區(qū)域模板進行檢索，發(fā)現(xiàn)膠原非螺旋區(qū)具有5K31、4AE2、4AEJ 3 個模板。以E-value得分以及比對結(jié)構(gòu)得分（total score）為依據(jù)，對3 種模板進行篩選。選擇較優(yōu)的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)，進行后續(xù)的計算。兔皮膠原α1、α2鏈的氨基酸序列和3 個模板的序列比對結(jié)果如圖2所示，模板相關(guān)信息見表1。

圖2 肽鏈α1、α2非螺旋部分殘基與模板5K31、4AE2、4AEJ 的序列比對Fig. 2 Sequence alignment of α1, α2 non-helical residues with 5K31,4AE2 and 4AEJ templates

表1 同源性模板序列比對結(jié)果Table 1 Results of homologous template sequence alignment

通過圖2的序列比對可知，兔皮膠原氨基酸序列與模板的覆蓋率為71%～74%，序列匹配一致性為63%～91%，具有較高的一致性。表1顯示的是3 種模板的得分情況，一般來說總體分值高于300或者E值小于1 e－5的晶體可以作為候選模板進行同源建模[27]。由表1可知，5K31、4AE2、4AEJ 3 個模板均滿足以上條件。為此，通過YASARA軟件對3 個模板進行混合建模以進一步篩選，在這一過程中只有模板5K31通過了模型迭代，因此確定5K31為最終模板。所構(gòu)建的非螺旋區(qū)模型如圖3所示。

圖3 非螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)模型示意圖Fig. 3 Schematic representation of the non-helical region model

2.1.2 三螺旋區(qū)模型構(gòu)建

膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)具有典型性，通過CC Builder Mk.2軟件可直接進行I型膠原蛋白三螺旋區(qū)域模型的構(gòu)建，模型構(gòu)建結(jié)果如圖4所示。

圖4 三螺旋結(jié)構(gòu)模型示意圖Fig. 4 Schematic representation of the triple-helix model

由圖4可知，構(gòu)建的三螺旋結(jié)構(gòu)的α1與α2鏈均為左手螺旋（圖4A），3 個螺旋再形成右手超螺旋結(jié)構(gòu)，并且3 條α肽鏈將相互交錯排列（圖4B），這些結(jié)構(gòu)特征都與膠原蛋白結(jié)構(gòu)相符合，說明通過此方法構(gòu)建的三螺旋結(jié)構(gòu)在空間構(gòu)象上合理。

2.2 模型評價

采用PROCHECK和ERRAT程序?qū)?yōu)化后模型蛋白的結(jié)構(gòu)進行評價。拉氏圖（Ramachandran plot）主要用于指明蛋白質(zhì)或肽中氨基酸殘基的允許和不允許的構(gòu)象。拉氏圖主要分為3 個區(qū)域：允許區(qū)（紅色區(qū)域）、最大允許區(qū)（黃色區(qū)域）和不允許區(qū)（空白區(qū)域），圖中的黑點代表氨基酸二面角。三螺旋結(jié)構(gòu)模型的拉氏圖顯示，模型中100%氨基酸二面角位于允許區(qū)（圖5）。而非螺旋肽結(jié)構(gòu)模型99.2%的氨基酸二面角在合理的范圍之內(nèi)，2 個模型均符合立體化學(xué)能量規(guī)則。

圖5 三螺旋結(jié)構(gòu)模型和非螺旋肽結(jié)構(gòu)模型的拉氏圖Fig. 5 Ramachandran plots of the triple-helix and non-helix models

2.3 單體系動力學(xué)模擬

實際明膠化過程是將膠原蛋白在質(zhì)量分數(shù)為1% HCl溶液中進行5 min～24 h不等時間的酸處理。在分子模擬過程中，計算機處理時間與實際時間代表的含義不同，綜合考慮計算機的處理能力，在模擬過程中設(shè)定總處理時間為200 ns，旨在觀察二級結(jié)構(gòu)的變化情況。

2.3.1 非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD分析結(jié)果

均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）可以近似顯示出體系構(gòu)象的相對變化。單個、多個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD分別按式（1）、（2）計算。

式中：Rmsdi是第i個構(gòu)象的RMSD，表示第i個構(gòu)象與參照構(gòu)象的平均偏差；Ne是構(gòu)象數(shù)；σR是Ne個構(gòu)象的Rmsdi漲落；Rd描述了Ne個構(gòu)象的平衡程度。

由圖6可知，對同源建模得到的非螺旋肽進行了200 ns的動力學(xué)模擬分析。在質(zhì)量分數(shù)為1% HCl條件下，單個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD波動較小，只達到5 ?左右，說明酸處理對單個非螺旋肽結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化影響較小。為此，本研究又觀察了多個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD變化，相比之下，2 個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD波動較大，在100 ns時達到30 ?左右。在0～100 ns期間，2 個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD呈現(xiàn)上升趨勢；而在100 ns后，2 個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD呈下降趨勢。在180～200 ns期間，2 個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD漸穩(wěn)定。

圖6 I型膠原蛋白非螺旋肽結(jié)構(gòu)RMSD隨模擬時間的變化趨勢Fig. 6 Change in of RMSD of non-helical peptides over simulation time

通過2 種體系的RMSD對比分析，發(fā)現(xiàn)多個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的RMSD波動十分明顯，為進一步分析多個非螺旋肽結(jié)構(gòu)在實驗條件下RMSD波動較大的原因，每50 ns提取動力學(xué)軌跡進行作圖分析，非螺旋肽結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化結(jié)果如圖7所示。

圖7 非螺旋肽結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化Fig. 7 Changes in non-helix structures over simulation time

隨著模擬時間推移，原本結(jié)合在一起的非螺旋肽部分逐漸分離。這是由于在強酸條件下，非螺旋肽能夠被質(zhì)子化，在0～200 ns期間，非螺旋肽間的相互排斥作用使得非螺旋肽間彼此分離。0～100 ns期間非螺旋肽逐漸分散，相互排斥作用也導(dǎo)致非螺旋肽結(jié)構(gòu)波動增加，RMSD升高。100 ns后多個非螺旋肽基本分離。由于非螺旋肽結(jié)構(gòu)的緊密結(jié)合起著穩(wěn)定膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的重要作用，因此在強酸條件下，多個非螺旋肽結(jié)構(gòu)的分離將導(dǎo)致膠原蛋白的三螺旋肽結(jié)構(gòu)易于被酸破壞。

2.3.2 非螺旋肽的二級結(jié)構(gòu)變化分析結(jié)果

為進一步探究非螺旋肽在質(zhì)量分數(shù)為1%的HCl條件下二級結(jié)構(gòu)的變化情況，對此條件下非螺旋肽二級結(jié)構(gòu)相對含量變化情況進行分析，結(jié)果如圖8所示。

圖8 非螺旋區(qū)域二級結(jié)構(gòu)含量隨模擬時間的變化趨勢Fig. 8 Changes in secondary structure contents in non-helical regions over simulation time

由圖8可知，在酸處理條件下，相對于單個非螺旋肽，多個非螺旋肽的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量有所增加，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量有所下降。該結(jié)果說明，酸處理使得非螺旋肽的質(zhì)子化，導(dǎo)致非螺旋肽間彼此相互排斥，原本緊密結(jié)合的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在正電荷相互排斥過程中，部分向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)換。

多個非螺旋肽的二級結(jié)構(gòu)變化顯示，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量穩(wěn)定在15%左右，β-折疊相對含量為30%左右，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲二者相對含量總和在50%～60%左右。從二級結(jié)構(gòu)變化情況可以看出，多個非螺旋肽各個二級結(jié)構(gòu)相對含量雖然有一定變化但是并不明顯，在酸處理條件下，該部分結(jié)構(gòu)彼此分離后，空間結(jié)構(gòu)并不會有太大改變，說明該部分不是引起實驗上二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)變化的主要區(qū)域。

2.3.3 三螺旋結(jié)構(gòu)的RMSD分析結(jié)果

為了觀察三螺旋結(jié)構(gòu)在酸處理條件下的構(gòu)象變化，對單個三螺旋結(jié)構(gòu)進行了200 ns的動力學(xué)模擬分析，RMSD的分析結(jié)果如圖9所示。在0～30 ns期間，RMSD呈現(xiàn)上升趨勢，在30 ns時RMSD波動達到30 ?。在30～50 ns期間，RMSD逐漸穩(wěn)定，在27～30 ?范圍內(nèi)波動，系統(tǒng)評價50 ns后RMSD將一直處于平穩(wěn)狀態(tài)，說明50 ns后易于明膠化部分的三螺旋結(jié)構(gòu)已基本被破壞，剩余組分結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在短時間內(nèi)不會發(fā)生變化，這與兔皮膠原明膠化過程中實際酸處理1 h內(nèi)的情況類似，同時也說明相比于非螺旋區(qū)域，三螺旋區(qū)域的變化較為迅速，這可能是因為非螺旋區(qū)對三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有保護作用，伴隨著非螺旋肽的分開，原本結(jié)合在一起的膠原分子被分離，導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)充分暴露在酸環(huán)境中，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更易被破壞。

圖9 單個三螺旋結(jié)構(gòu)的RMSD隨模擬時間的變化趨勢Fig. 9 Changes in RMSD in single triple-helix structure over simulation time

2.3.4 三螺旋結(jié)構(gòu)氫鍵含量分析結(jié)果

生物體系中最普遍、最基礎(chǔ)的物質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能都與氫鍵密切相關(guān)[28-30]，在結(jié)構(gòu)上蛋白質(zhì)最重要的二級結(jié)構(gòu)是由氫鍵決定的。為保證模擬過程更接近真實情況，對多個三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵變化情況進行分析，結(jié)果如圖10所示。

在0～50 ns，三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量從開始的225下降到175，說明此時被質(zhì)子化的三螺旋結(jié)構(gòu)由于正電荷排斥作用導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，原始構(gòu)象遭到了破壞；在50～200 ns期間，三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量基本保持在175左右，此時氫鍵數(shù)量處于相對平衡狀態(tài)，這可能是因為肽鏈間相互折疊卷曲不斷形成新的氫鍵。本課題組先前有研究表明：實際明膠化過程中酸處理5 min使膠原的原結(jié)構(gòu)破壞，氫鍵數(shù)量降低，1 h后隨酸處理時間延長，氫鍵數(shù)量維持穩(wěn)定[9]，故說明酸處理1 h與分子模擬50 ns的結(jié)果具有高度一致性，對于兔皮膠原來說，酸處理1 h以內(nèi)為最有效明膠化時間。

圖10 三螺旋結(jié)構(gòu)中氫鍵數(shù)量隨模擬時間的變化情況Fig. 10 Changes in the number of hydrogen bonds in a three-helix structure over simulation time

2.3.5 三螺旋區(qū)的二級結(jié)構(gòu)變化分析結(jié)果

三螺旋結(jié)構(gòu)是膠原蛋白特有的二級結(jié)構(gòu)，在酸處理中，三螺旋結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，膠原肽鏈逐步轉(zhuǎn)化為其他二級結(jié)構(gòu)。為進一步分析三螺旋區(qū)域二級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，對兔皮膠原最有效的明膠化時間即分子模擬50 ns（實際酸處理1 h）內(nèi)，每10 ns提取動力學(xué)軌跡進行分析，分析結(jié)果如圖11所示。

圖11 三螺旋結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化Fig. 11 Changes of three-helix structures over simulation time

未處理時，三螺旋結(jié)構(gòu)完整有序；當加入酸處理條件時，膠原三螺旋空間結(jié)構(gòu)立即被打破，肽鏈松散呈無序狀態(tài)，二級結(jié)構(gòu)逐漸暴露。因軟件無法區(qū)分松散的三螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在此本研究列出了其他3 種二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化趨勢。隨著酸處理時間的延長，3 種有序二級結(jié)構(gòu)的總含量整體呈現(xiàn)增加趨勢，說明三螺旋結(jié)構(gòu)逐漸被破壞部分轉(zhuǎn)化為其他二級結(jié)構(gòu)。在3 種結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊相對含量始終未超過10%，原因在于膠原三螺旋區(qū)域含有大量脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp），這2 種氨基酸無法參與α-螺旋和β-折疊形成，但α-螺旋和β-折疊相對含量之和在明膠化過程中隨著酸處理時間的延長而增加，到40 ns時達到最大值，而后開始下降，說明此時膠原中肽鏈中空間結(jié)構(gòu)進一步展開，轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲，同時氫鍵達到平衡，展開的肽鏈在酸的作用下可能開始降解，造成得率開始下降。本課題組前期研究過程中發(fā)現(xiàn)α-螺旋和β-折疊相對含量之和與明膠得率具有較強相關(guān)性[9]，與本研究結(jié)果一致，說明當α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大時，明膠化程度最優(yōu)。

綜上所述，酸誘導(dǎo)兔皮明膠化過程中，隨著酸處理開始，膠原非螺旋區(qū)亞基在酸的作用下開始分離，膠原三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，轉(zhuǎn)化為其他二級結(jié)構(gòu)，當膠原肽鏈中α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大值時，膠原明膠化程度達到最優(yōu)。

3 結(jié) 論

對兔皮明膠化過程進行分子模擬，通過模板選擇和YASARA同源建模構(gòu)建出了兔皮膠原的非螺旋結(jié)構(gòu)，采用CCBuilder Mk.2軟件構(gòu)建出兔皮膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)。采用PROCHECK和ERRAT程序?qū)?yōu)化后模型蛋白結(jié)構(gòu)進行評價，2 個模型均符合立體化學(xué)能量規(guī)則。Verify-3D檢測結(jié)果表明，2 個模型質(zhì)量良好。RMSD分析結(jié)果表明，隨著酸處理的進行，蛋白分子的非螺旋區(qū)亞基分離，但其中單個非螺旋區(qū)構(gòu)象變化較小。三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量變化表明，酸處理導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵數(shù)量在短時間內(nèi)迅速減少，模擬后期氫鍵數(shù)量保持相對穩(wěn)定，處于平衡狀態(tài)，與實際酸處理1 h內(nèi)的明膠化膠原紅外光譜的結(jié)果一致。三螺旋結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化結(jié)果表明，隨著非螺旋區(qū)亞基結(jié)構(gòu)的分離，膠原三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，轉(zhuǎn)化為其他二級結(jié)構(gòu)；α-螺旋和β-折疊相對含量之和呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當α-螺旋和β-折疊相對含量之和達到最大時，明膠化程度最優(yōu)。