岳曉月，吳佳蓉，王艷秋，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

近年來(lái)，納米藥物制劑在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中展現(xiàn)出巨大的潛力。納米凝膠作為一種新型的給藥系統(tǒng)，一般是指直徑在200 nm以下的水凝膠，其本體是一種三維網(wǎng)狀聚合物水凝膠。由于其較大的比表面積更有利于攜帶藥物富聚集于病灶，且能顯著提高藥物的生物利用度[1-2]。同時(shí)，納米凝膠具有普通凝膠體系具有的穩(wěn)定性、控釋性，有利于降低藥物的毒副作用[3-6]。此外，有研究表明納米凝膠，特別是表面進(jìn)行聚乙二醇（PEG）化修飾的的納米凝膠，可減少其被體內(nèi)免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞作為異物識(shí)別和吞噬，可以降低納米凝膠體系的免疫原性、增強(qiáng)其載體的穩(wěn)定性，進(jìn)而延長(zhǎng)藥物于體內(nèi)的滯留時(shí)間，具有長(zhǎng)循環(huán)效果，是藥物輸送的理想載體[7]。霧化吸入是目前治療慢性阻塞性肺病、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的常用給藥途徑，具有用藥劑量小、操作簡(jiǎn)便、起效快、有效避免肝臟首過(guò)效應(yīng)和不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)[8]。海藻酸鈉在水溶液中易與二價(jià)金屬陽(yáng)離子交聯(lián)形成凝膠，且具有良好的生物相容性[9-11]。

本研究結(jié)合海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以氯化鋅作為交聯(lián)劑，采用反相微乳法制備海藻酸鋅納米凝膠（ALG-NPs），后期將作為藥物的輸送載體，本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲袘B(tài)度，有必要對(duì)其超聲霧化吸入的安全性和可行性進(jìn)行初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g，雌雄各半，購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，保持自由飲水和進(jìn)食，環(huán)境溫度為（24±1）℃，濕度為55%±5%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只動(dòng)物僅使用1次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）指導(dǎo)原則和天津中醫(yī)藥大學(xué)的倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 海藻酸鈉（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。液體石蠟（分析純）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。司盤（Span）80和吐溫（Tween）80購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。氯化鋅（分析純）購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。溴化鉀（光譜純）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 萬(wàn)分之一精密分析天平，AL204，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司。頂置式電子攪拌器，EURO-STPCV S25，IKA公司。加熱型磁力攪拌器，RCT basic，IKA 公司。精密蠕動(dòng)泵，BT100-2J，保定蘭格恒流泵有限公司。冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)DU-2100，EYELA公司。激光粒徑測(cè)定儀，Zetasizer Nano-Zs，Malvern公司。透射電子顯微鏡，H-7650，Hitachi公司。差示掃描量熱儀，Jade，Perkin Elemer公司。傅立葉變換紅外光譜儀，Thermo公司。超聲霧化器，402AI，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療器械股份有限公司。熒光顯微鏡，DM 4000 B，Leica儀器公司。多功能讀板機(jī)，Infinite M200，TECAN公司。動(dòng)物裝置：自制不完全封閉有機(jī)玻璃箱，20 cm×13 cm×15 cm，箱體兩端一端為通氣孔，另一端接超聲霧化器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ALG-NPs的制備 將多功能真空攪拌器與頂置式攪拌機(jī)連接固定，于500 mL三頸瓶中分別加入150 mL液體石蠟、1.05 mL Span 80和 0.45 mL Tween 80，于40℃水浴，500 r/min條件下充分分散30 min作為油相。將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)至1 000 r/min，使用蠕動(dòng)泵將45 mL濃度為0.5%（W/V）海藻酸鈉溶液緩慢滴入油相中，控制流速0.75 mL/min，滴加完畢后持續(xù)攪拌1 h，使水相與油相充分混勻。使用蠕動(dòng)泵加入固化劑15 mL（含有0.1%氯化鋅的60%乙醇溶液），控制流速0.15 mL/min，攪拌轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h。最后，將圓底燒瓶中液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，稱質(zhì)量，3 800 r/min離心10 min，分離水相得到ALG-NPs，液氮速凍并冷凍干燥保存，備用[12]。

2.2 ALG-NPs表征分析

2.2.1 粒徑及Zeta電位測(cè)試 將制得的ALG-NPs溶液稀釋10倍，采用納米粒度儀測(cè)定納米凝膠的粒徑及分布和表面Zeta電位，室溫下重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

2.2.2 透射電子顯微鏡（TEM）分析 取少量ALGNPs，重懸于超純水中，將懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫晾干，在TEM下觀察納米凝膠的形貌（樣品未經(jīng)任何染色）。

2.2.3 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 將干燥的海藻酸鈉和ALG-NPs分別與KBr混合壓片，以空白KBr片作為對(duì)照，在傅里葉變換紅外光譜儀上對(duì)樣品的紅外光譜進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

2.2.4 差示掃描量熱（DSC）分析 稱取干燥的海藻酸鈉和ALG-NPs 6～8 mg分別置于密閉鋁盤中，以空白鋁盤作為對(duì)照，在恒定氮?dú)饬飨拢?0 mL/min），調(diào)節(jié)升溫速度為10℃/min，升溫范圍為30～350℃，記錄各樣品的DSC測(cè)定曲線。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g，雌雄各半，共48只，隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組（Control）、ALG-NPs低（100 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（200 mg/kg）劑量組。每組按取材時(shí)間分為7 d、14 d，2個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別放入20 cm×13 cm×15 cm不完全封閉的有機(jī)玻璃箱，空白對(duì)照組霧化吸入等體積的注射生理鹽水，各給藥組霧化吸入不同濃度的ALG-NPs，20 min/次，每天連續(xù)進(jìn)行霧化吸入給藥。各組小鼠每次霧化吸入后1 h均進(jìn)行一般情況觀察。

2.4 總體外觀及行為學(xué)評(píng)價(jià) 每次ALG-NPs超聲霧化吸入前及給藥后1 h觀察小鼠口、鼻部?jī)?nèi)外的可視范圍內(nèi)有無(wú)流血、紅腫、潰瘍等現(xiàn)象，同時(shí)觀察ALG-NPs超聲霧化吸入后1 h小鼠全身狀況及局部刺激癥狀（如有無(wú)咳嗽、哮喘、窒息、嘔吐等癥狀）。

2.5 血清采集及肺組織取材 各組分別于7、14 d末次霧化吸入后1 h取6只小鼠留取生化及肺組織標(biāo)本。采用摘眼球取血并收集于離心管中，然后于37℃水浴靜置30 min后，3 000 r/min，離心15 min，收集上部血清，棄沉淀，-20℃保存用于相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)。打開(kāi)胸腔，完整取出小鼠肺部組織并修剪，去除周圍組織及氣管，濾紙吸去殘留血漬，稱取肺組織濕質(zhì)量，計(jì)算肺系數(shù)：全肺濕質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。肉眼觀察肺臟大小、顏色及表面病變等。即刻取右肺上葉及同部位氣管、支氣管約0.5 cm小段，放入4%的中性福爾馬林中固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚 4 μm，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下進(jìn)行小鼠肺組織和氣管組織病理觀察。

2.6 血清及肺組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定 按照eBioscience公司IL-6和TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定血清及肺組織中IL-6和TNF-α的濃度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并做圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±SE）表示，組間比較使用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ALG-NPs粒徑及Zeta電位 納米粒的粒徑大小及分布是影響粒子分散體系物理穩(wěn)定性的重要因素，粒徑分布通常以多分散性系數(shù)（PDI）評(píng)價(jià)，一般認(rèn)為PDI<0.3時(shí)，表明該納米粒的粒徑分布均勻，大小均一[13]。ALG-NPs所測(cè)定的平均粒徑為（71.24±2.12）nm，PDI為 0.143±0.04，提示其粒徑分布較窄，符合納米制劑的一般要求。

納米粒電位測(cè)定是納米粒表面荷電性質(zhì)與荷電大小的標(biāo)志，是影響納米制劑分散性的重要參數(shù)，它不僅影響該類制劑的物理穩(wěn)定性，而且往往影響載藥納米粒的體內(nèi)分布與體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)[14]。帶負(fù)電荷的納米粒進(jìn)入體內(nèi)后可防止納米粒在血液中凝聚，避免非特異性清除，具有一定的長(zhǎng)循環(huán)效果。實(shí)驗(yàn)中制備的ALG-NPs所測(cè)定的平均Zeta電位為（-19.4±0.64）mV，提示其不易發(fā)生聚集，帶負(fù)電荷，可減少與血漿蛋白的結(jié)合，提高ALG-NPs在血液中的循環(huán)時(shí)間。

3.2 ALG-NPs外觀及微觀結(jié)構(gòu)與形貌 ALGNPs為半透明略帶乳光液體，肉眼觀察未見(jiàn)不溶性成分或絮凝樣聚集物。

ALG-NPs的透射電鏡照片如圖1所示，可見(jiàn)ALG-NPs形態(tài)圓整呈類球形，無(wú)粘連，表面光滑，電鏡測(cè)定的粒徑與激光粒徑測(cè)定儀所測(cè)得的結(jié)果一致。

圖1 ALG-NPs透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 The TEM microphotographs of ALG-NPs

3.3 FT-IR分析結(jié)果 樣品的紅外光譜譜圖如圖2所示。海藻酸鈉含有大量的羥基，羥基是強(qiáng)極性基團(tuán)，易與供電子基團(tuán)（如氨基、羥基、羰基等）形成氫鍵。隨著氫鍵締合程度的加強(qiáng)，O-H伸縮振動(dòng)頻率大幅度降低，譜帶加寬，強(qiáng)度增加。海藻酸鈉分子結(jié)構(gòu)中，羥基主要形成了多締合體，從而在3 426 cm-1處形成了強(qiáng)而寬的υ（O-H）吸收峰，在1 033 cm-1處為羥基的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 608 cm-1和1 413 cm-1處分別為羧酸根負(fù)離子的伸縮振動(dòng)（υcoo-）和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)（υascoo-）[15]。ALG-NPs在 3 421 cm-1處為O-H伸縮振動(dòng)吸收峰υ（O-H），與海藻酸鈉O-H伸縮振動(dòng)吸收峰υ（O-H）相比，其向低波數(shù)區(qū)移動(dòng)，分析可能是由于替代鈉離子形成ALG-NPs后，海藻酸結(jié)構(gòu)單元與二價(jià)鋅離子形成配位結(jié)構(gòu)，降低了O-H的鍵能和氫鍵的締合程度；2 925 cm-1、2 855 cm-1處為-CH2亞甲基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（υasC-H）和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（υC-H）；與海藻酸鈉分子中羧基特征峰（1 413 cm-1）相比，ALG-NPs中其吸收峰（1 457 cm-1）發(fā)生了紅移，分析其可能是由于二價(jià)鋅離子與海藻酸分子中羧基相互作用的結(jié)果。

圖 2 ALG-NPs（a）、海藻酸鈉（b）的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR transmission of ALG-NPs（a）and sodium alginate（b）

3.4 DSC分析結(jié)果 樣品的差示掃描量熱圖如圖3所示。海藻酸鈉在120℃附近出現(xiàn)了較寬的吸熱峰，此為海藻酸鈉內(nèi)部結(jié)合水的失去，在245℃附近有一個(gè)尖銳的放熱峰，對(duì)應(yīng)著海藻酸鈉的熱分解[16]。在ALG-NPs譜圖中，海藻酸鈉在245℃處的放熱峰移至250℃附近且其強(qiáng)度明顯減弱，這可能是由于海藻酸分子與二價(jià)鋅離子交聯(lián)形成ALG-NPs，使分子熱穩(wěn)定性提高。

3.5 小鼠一般狀態(tài)觀察結(jié)果 各組小鼠均較活潑，毛發(fā)光潔，呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)敏捷，未出現(xiàn)呼吸急促、精神不振和反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，且均未出現(xiàn)激惹、飲食飲水減少以及便溏等表現(xiàn)。給藥前及給藥后1 h各組小鼠口、鼻部外的可視范圍內(nèi)均未出現(xiàn)紅腫、流血、異常分泌物、潰瘍等現(xiàn)象。與空白對(duì)照組比較，ALG-NPs各劑量組小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)明顯異常。

圖 3 ALG-NPs（a）、海藻酸鈉（b）的差示掃描量熱圖Fig.3 DSC thermograms of ALG-NPs（a）and sodium alginate（b）

3.6 小鼠肺組織病理解剖觀察結(jié)果 如圖4所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，各組小鼠雙肺外觀形態(tài)無(wú)明顯差異，均呈淡粉色，表面光滑，觸之柔軟，彈性好。與給藥7 d后的各組小鼠肺組織相比，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d的各組小鼠雙肺稍皺縮，彈性尚可，但ALG-NPs高劑量組雙肺部分區(qū)域呈暗紅色，有炎癥發(fā)生。

圖4 小鼠肺組織病理解剖照片F(xiàn)ig.4 Pathological anatomic photographs of lung tissue in mice

3.7 肺組織及氣管顯微病理學(xué)觀察結(jié)果 如圖5所示，空白對(duì)照組小鼠終末支氣管及細(xì)支氣管管腔光滑，上皮完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄且肺泡間隔正常，管壁及肺泡壁無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或明顯滲出性改變。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，ALGNPs組小鼠肺組織病理學(xué)特征與空白對(duì)照組基本一致，未見(jiàn)明顯異常改變。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d后，ALG-NPs高劑量組肺泡腔及間質(zhì)偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但肺泡結(jié)構(gòu)正常。ALG-NPs低劑量及中劑量組小鼠肺組織病理學(xué)特征與空白對(duì)照組基本一致。

圖5 小鼠肺組織顯微病理照片（×200，標(biāo)尺：200 μm）Fig.5 Micropathological photos of the lung tissue in mice（×200，scale bar：200 μm）

如圖6所示，空白對(duì)照組小鼠氣管病理切片顯微照片可見(jiàn)氣管黏膜清楚分為黏膜層、黏膜下層和外膜層，管腔呈圓形，且未見(jiàn)內(nèi)陷、閉塞、狹窄、異常增生物或分泌物等。黏膜層由纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成的纖毛上皮完整覆蓋于氣管內(nèi)表面，且未見(jiàn)脫落、缺失等病變。上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，黏膜及黏膜下層未見(jiàn)出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。氣管環(huán)正常，且未見(jiàn)斷裂、缺損等病變，外膜完整。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，ALG-NPs各劑量組小鼠氣管病理切片顯微照片與對(duì)正常照組小鼠基本一致，未見(jiàn)明顯異常改變。

圖6 小鼠氣管顯微病理照片（×200，標(biāo)尺：200 μm）Fig.6 Micropathological photos of the trachea in mice（×200，scale bar：200 μm）

3.8 肺系數(shù) 急性肺損傷重要的病理標(biāo)志為肺微血管通透性增加，當(dāng)肺內(nèi)液體滲出和吸收的平衡遭到破壞時(shí)，常表現(xiàn)為富含炎性介質(zhì)的液體滲入組織間隙，從而引起肺水腫[17]。肺系數(shù)可反映肺水腫、肺纖維化以及肺部感染等情況。因此，測(cè)定各組小鼠肺系數(shù)考察研究超聲霧化吸入ALG-NPs對(duì)小鼠肺組織的影響。肺系數(shù)結(jié)果如圖7所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，與空白對(duì)照組相比較，ALG-NPs各劑量組小鼠肺系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示在本實(shí)驗(yàn)中超聲霧化吸入ALG-NPs對(duì)小鼠肺組織損傷較小。

圖7 各組小鼠肺系數(shù)（n=6）Fig.7 Lung index in each group（n=6）

3.9 血清及肺組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定 如圖8所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，與空白對(duì)照組比較，ALG-NPs各劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ALGNPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d后，與空白對(duì)照組比較，ALG-NPs高劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），提示有炎癥發(fā)生，與肺組織病理解剖觀察結(jié)果一致。ALG-NPs低及中劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖9所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，與空白對(duì)照組比較，ALG-NPs各劑量組血清及肺組織勻漿中TNF-α水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

納米凝膠作為一種新型的給藥系統(tǒng)，能借助納米粒的特殊性質(zhì)顯著提高難溶性藥物的溶解度和穩(wěn)定性，并具有緩釋和靶向的特點(diǎn)，是靶向給藥的理想載體[18]。海藻酸鈉是由直鏈鍵合的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）組成的無(wú)規(guī)嵌段共聚物，是一種低毒、可生物降解、生物相容性好的常用制藥輔料。其中，在藥物/蛋白質(zhì)輸送載體的研究中，海藻酸鈣凝膠珠或微球已經(jīng)得到了較高的關(guān)注[19-20]。本研究構(gòu)建了ALG-NPs，以期作為藥物的緩釋載體通過(guò)超聲霧化吸入靶向輸送至肺，為治療呼吸系統(tǒng)疾病提供參考。

圖8 ALG-NPs對(duì)小鼠血清（A）及肺組織（B）中IL-6水平的影響（n=6）Fig.8 Effects of ALG-NPs on IL-6 levels in the serum and the lung tissue of mice（n=6）

圖9 ALG-NPs對(duì)小鼠血清（A）及肺組織（B）中TNF-α水平的影響（n=6）Fig.9 Effects of ALG-NPs on TNF-α levels in the serum and the lung tissue of mice（n=6）

超聲霧化吸入是利用超聲波產(chǎn)生的能量，使藥液于氣相中分散，形成直徑<5 μm的霧滴，隨著自主呼吸使藥物直接作用于咽喉、氣管、支氣管及肺泡等部位[21]。由于肺部具有特有的生理解剖特點(diǎn)，如肺泡表面積巨大（大約100 m2）、毛細(xì)血管網(wǎng)豐富、肺泡上皮細(xì)胞膜較薄、氣血通路狹小等[22]，與其他給藥途徑相比，霧化吸入具有局部藥物濃度高、起效迅速、操作簡(jiǎn)便及不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，符合臨床給藥需求，提高了患者的順應(yīng)性，利于臨床的普及與推廣[8]。

藥物超聲霧化吸入對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)通常是對(duì)呼吸道和肺部的刺激，TNF-α是炎癥及應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中最早出現(xiàn)且最重要的炎性介質(zhì)之一，同時(shí)也是急性肺損傷發(fā)病的啟動(dòng)因子，多種原因?qū)е碌臋C(jī)體炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài)均會(huì)伴隨TNF-α的生成和釋放[23]。當(dāng)炎癥及應(yīng)激反應(yīng)等原因刺激機(jī)體時(shí)，TNF-α可啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞刺激機(jī)體生成和分泌IL-6[24]，在血清和局部組織中會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)，IL-6作為重要的炎性介質(zhì)，與組織的損傷程度成正相關(guān)[25]。機(jī)體長(zhǎng)期（14 d）超聲霧化吸入大劑量外源性藥物ALG-NPs后，會(huì)引起機(jī)體血清及局部肺組織勻漿中IL-6水平增高，ALG-NPs高劑量組較為顯著，ALG-NPs低、中劑量霧化時(shí)對(duì)機(jī)體刺激性不大。當(dāng)機(jī)體隨著刺激頻次的增加，機(jī)體耐受程度逐漸提高，機(jī)體對(duì)TNF-α的免疫應(yīng)答水平逐漸降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[26]。

以上結(jié)果提示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入后，對(duì)小鼠肺組織及氣道無(wú)明顯損傷即局部刺激性較小，且于安全劑量范圍內(nèi)（≤150 mg/kg）無(wú)任何炎癥反應(yīng)，對(duì)于納米凝膠制劑的基礎(chǔ)研究和臨床推廣具有一定的參考價(jià)值。