陶騰州，李秉鈞，趙 業(yè)，王昕宇

(煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005 )

擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥是由除蟲(chóng)菊酯合成的新型第三代農(nóng)藥，作為一類高效、廣譜、低毒的殺蟲(chóng)劑，目前己廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)滅害及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1-2]，是傳統(tǒng)有機(jī)磷、有機(jī)氯等水產(chǎn)殺蟲(chóng)劑的理想替代品。近年來(lái)，擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致殘留農(nóng)藥通過(guò)地表徑流、雨水沖刷、生活廢水等途徑進(jìn)入水環(huán)境，這直接或間接地破壞了近海養(yǎng)殖水環(huán)境，并對(duì)其中水生生物的生存造成嚴(yán)重威脅[3-5]，因此有必要開(kāi)展擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)水生生物的毒性研究。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動(dòng)物門、刺參科、仿刺參屬，是一種營(yíng)底棲、碎屑食性的溫帶海洋性物種[6-7]。由于自然分布和地理環(huán)境限制，北方仿刺參養(yǎng)殖主要分布于山東、河北、遼寧等地沿海[8]，相關(guān)研究表明，在黃渤海海區(qū)沉積物中存在擬除蟲(chóng)菊酯殘留[9]，其中溴氰菊酯(106.6 μg/kg)、氯氰菊酯(87.7 μg/kg)，會(huì)對(duì)海域內(nèi)仿刺參生存造成潛在威脅。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)仿刺參毒性的研究主要集中于重金屬、抗生素、有機(jī)磷等方面[10-12]，而擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參的毒性效應(yīng)研究卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以重要的海水養(yǎng)殖物種仿刺參幼參作為研究對(duì)象，探討3種擬除蟲(chóng)菊酯(溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯)對(duì)仿刺參的急性毒性效應(yīng)，確定3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參的安全用量和毒性等級(jí)，旨在為科學(xué)的評(píng)估仿刺參養(yǎng)殖環(huán)境提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)藥劑

試驗(yàn)仿刺參幼參平均體質(zhì)量(2.03±0.42) g，平均體長(zhǎng)(3.16±0.62) cm，購(gòu)自煙臺(tái)某育苗場(chǎng)，為人工繁殖飼養(yǎng)6月齡的幼參。幼參在室內(nèi)50 L塑料箱內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間日換水1次，隔日投喂餌料1次。試驗(yàn)開(kāi)始1 d前停止投喂餌料，隨機(jī)分組用于試驗(yàn)。

溴氰菊酯乳液由拜耳杭州作物科學(xué)有限公司生產(chǎn),質(zhì)量濃度為25 g/L。試驗(yàn)所用氯氰菊酯、氰戊菊酯均由南京羅邁美試劑公司提供，純度均為96%，先以丙酮配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的母液，使用時(shí)稀釋至所需質(zhì)量濃度，每24 h更新1次試驗(yàn)藥液。

1.2 試驗(yàn)海水

試驗(yàn)用海水取自煙臺(tái)近海，經(jīng)砂濾除雜質(zhì)，pH 7.47，溶解氧水平7.56 mg/L，鹽度31.65，水溫20.2 ℃，置于消毒玻璃缸中待用。

1.3 急性毒性試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)梯度設(shè)置

參照《水生生物檢測(cè)手冊(cè)》中半靜水毒性試驗(yàn)法[13]，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所得質(zhì)量濃度范圍，采用等對(duì)數(shù)間距法計(jì)算設(shè)置仿刺參幼參急性試驗(yàn)的質(zhì)量濃度梯度(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯的預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度梯度分別為0.07、0.10、0.14、0.21、0.30 mg/L，0.55、0.68、0.85、1.05、1.30 mg/L，0.75、0.98、1.27、1.65、2.15 mg/L)。每組藥物質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行組，并添加一組空白對(duì)照組[其中氯氰菊酯和氰戊菊酯增設(shè)丙酮(助溶劑體積比為2‰)對(duì)照組]，其他試驗(yàn)條件與毒性處理組完全一致。

1.3.2 試驗(yàn)管理

在室溫靜水條件下，在3 L玻璃燒杯中進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，每組燒杯中養(yǎng)殖水體為3 L并放入暫養(yǎng)幼參10頭。試驗(yàn)期間不投喂不充氣，保持水溫為19.5～21.5 ℃，每隔24 h全量換水1次，保持各組擬除蟲(chóng)菊酯質(zhì)量濃度與原始預(yù)設(shè)質(zhì)量濃度一致，并對(duì)燒杯進(jìn)行保鮮膜密封處理。試驗(yàn)期間每隔4 h(夜間除外)觀察1次幼參狀態(tài)并記錄掛壁個(gè)數(shù)和死亡個(gè)數(shù)(幼參死亡的判定以沉入燒杯底部、管足無(wú)吸附能力、對(duì)輕微刺激無(wú)反應(yīng)、放入自然海水不能復(fù)活為準(zhǔn)[14])，及時(shí)清除死亡個(gè)體保證水質(zhì)免受污染。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算

各試驗(yàn)組取3個(gè)平行組的平均值計(jì)算死亡率和附壁率。其中死亡率按下式進(jìn)行校正：

P=(P′-C)/(100-C)

式中，P為經(jīng)校正后的試驗(yàn)組的死亡率(%)，C為對(duì)照組死亡率(%)，P′為試驗(yàn)組取平行組平均值的死亡率(%)。

附壁率是用來(lái)評(píng)價(jià)幼參附著能力和活動(dòng)情況的參數(shù)，按下式計(jì)算：

AR=NA/10×100%

式中，AR為附壁率(%)，NA為附著在燒杯壁上的幼參

數(shù)(頭)。

采用SPSS 18.0軟件Probit回歸分析，用概率單位法做出質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)—概率單位線性方程，并計(jì)算出3種擬除蟲(chóng)菊酯藥物對(duì)幼參的24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度(LC50)及95%置信區(qū)間。安全質(zhì)量濃度(SC)按下式計(jì)算[15]：

SC=96 h LC50×0.1

2 結(jié) 果

2.1 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參死亡率的影響

在3種擬除蟲(chóng)菊酯藥物對(duì)仿刺參幼參急性毒性試驗(yàn)過(guò)程中，空白對(duì)照組和助溶劑對(duì)照組幼參均未出現(xiàn)死亡；通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得到各時(shí)間段質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與概率單位的回歸方程(表1)，并計(jì)算出3種藥物作用下仿刺參幼參的半致死質(zhì)量濃度及相應(yīng)95%置信區(qū)間(表1)。其中，溴氰菊酯、氯氰菊酯、及氰戊菊酯對(duì)仿刺參幼參的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.110、0.787、1.189 mg/L，表明3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性存在較大差異。同時(shí)，不同質(zhì)量濃度擬除蟲(chóng)菊酯下幼參的死亡呈現(xiàn)出不同的模式(圖1),如溴氰菊酯組，中低質(zhì)量濃度(0.05～0.08 mg/L)處理組幼參的死亡個(gè)數(shù)較少，而高質(zhì)量濃度(0.12～0.30 mg/L)處理組死亡率迅速增加(圖1a)；氯氰菊酯試驗(yàn)組，48 h時(shí)各藥物質(zhì)量濃度中幼參死亡率相比24 h增加較大(圖1b)。根據(jù)96 h半致死質(zhì)量濃度，計(jì)算出3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參的安全質(zhì)量濃度分別為0.011、0.079、0.119 mg/L，根據(jù)OECD1992年的化合物對(duì)水生生物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]可知，溴氰菊酯和氯氰菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性分級(jí)為極毒，氰戊菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性分級(jí)為高毒。

表1 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參急性毒性作用及安全質(zhì)量濃度分析

注：回歸方程中，x表示質(zhì)量濃度(mg/L)的對(duì)數(shù)，y表示死亡率(%).

圖1 3種不同質(zhì)量濃度擬除蟲(chóng)菊酯處理下仿刺參幼參的死亡率

2.2 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參附壁率的影響

與死亡率相似，幼參附壁率隨處理時(shí)間和擬除蟲(chóng)菊酯質(zhì)量濃度增大而降低(圖2)。試驗(yàn)期間，對(duì)照組仿刺參附壁率為96%～100%，變化不大，而不同藥物處理下的附壁率則呈現(xiàn)差異表現(xiàn)。在氯氰菊酯中(圖2b)，附壁率在24 h后下降緩慢，而在48 h后均出現(xiàn)明顯下降；在氰戊菊酯中(圖2c)，附壁率在中低質(zhì)量濃度組(0.75～0.98 mg/L)中下降緩慢，而高質(zhì)量濃度組藥物(1.27～2.51 mg/L)處理后明顯下降。

圖2 3種不同質(zhì)量濃度擬除蟲(chóng)菊酯處理下仿刺參幼參的附壁率

2.3 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參的中毒癥狀和死亡狀態(tài)的影響

不同種類擬除蟲(chóng)菊酯脅迫情況下的幼參的中毒癥狀和死亡特征呈現(xiàn)一定的相似和差異表現(xiàn)(表2)。受試幼參在接觸3種藥物以后，在藥物刺激下出現(xiàn)了不同程度吐腸現(xiàn)象，且幼參在死亡后身體呈僵硬狀態(tài)。溴氰菊酯和氯氰菊酯試驗(yàn)組受試幼參在接觸藥物后，存在較嚴(yán)重幼參吐腸情況，數(shù)量隨質(zhì)量濃度增大呈上升趨勢(shì)，且在死亡幼參皮膚表面存在化皮現(xiàn)象；氰戊菊酯試驗(yàn)組仿刺參幼參在受藥物刺激后只在高質(zhì)量濃度組(1.27～2.51 mg/L)存在輕微吐腸情況，死亡幼參皮膚表面未見(jiàn)明顯化皮。

表2 不同種類擬除蟲(chóng)菊酯處理下仿刺參幼參中毒癥狀及死亡特征

3 討 論

3.1 3種藥物對(duì)仿刺參幼參的毒性評(píng)價(jià)

3.1.1 溴氰菊酯

3種擬除蟲(chóng)菊酯中溴氰菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性最強(qiáng)，96 h半致死質(zhì)量濃度為0.110 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級(jí)為極毒物質(zhì)?，F(xiàn)有研究中溴氰菊酯對(duì)魚(yú)、蝦、貝類的毒性研究較為全面，且發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同種類生物的毒性效應(yīng)存在較大差異。Koprucu等[17]報(bào)道了溴氰菊酯對(duì)鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)的96 h半致死質(zhì)量濃度為0.213 μg/L；吳楠等[18-19]研究表明，溴氰菊酯對(duì)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的肌細(xì)胞和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的血細(xì)胞DNA造成損傷；鐘碩良等[20]報(bào)道，溴氰菊酯對(duì)文蛤(Meretrixmeretrix)和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.27 mg/L和0.06 mg/L。對(duì)比上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯對(duì)甲殼類、魚(yú)類的毒性較強(qiáng)，對(duì)仿刺參等無(wú)脊椎動(dòng)物次之，對(duì)軟體動(dòng)物的影響較低。

3.1.2 氯氰菊酯

氯氰菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性較溴氰菊酯弱，96 h半致死質(zhì)量濃度為0.787 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級(jí)，為極毒物質(zhì)。相比于其他水生生物而言，仿刺參對(duì)氯氰菊酯的敏感程度較低。Das等[21]對(duì)南亞野鯪(Labeorohita)進(jìn)行氯氰菊酯的急性毒性試驗(yàn)，得出96 h半致死質(zhì)量濃度為0.14 mg/L；譚曉珍等[22]研究發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯對(duì)櫛孔扇貝(Chlamysfarreri) 96 h半致死質(zhì)量濃度為0.24 mg/L；Burredge等[23]對(duì)美洲螯龍蝦(Homarusamericanus)成體使用氯氰菊酯脅迫后,得到其96 h半致死質(zhì)量濃度為0.04 μg/L。本試驗(yàn)中氯氰菊酯對(duì)仿刺參幼參96 h半致死質(zhì)量濃度為0.787 mg/L，可見(jiàn)不同種類動(dòng)物對(duì)氯氰菊酯的敏感性是不同的，一般為蝦類>魚(yú)類>貝類，仿刺參幼參對(duì)氯氰菊酯的敏感性低于其他水生生物。

3.1.3 氰戊菊酯

與上述兩種藥物相比，氰戊菊酯對(duì)仿刺參幼參的毒性最弱，96 h半致死質(zhì)量濃度為1.189 mg/L，根據(jù)水生生物毒性分級(jí)，為高毒物質(zhì)。與其他水生生物相比，仿刺參幼參對(duì)氰戊菊酯的敏感程度較低。吳琴瑟等[24]報(bào)道了氰戊菊酯對(duì)幾種對(duì)蝦的毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氰戊菊酯質(zhì)量濃度為0.6 mg/L時(shí)，所有蝦類在85 min內(nèi)全部死亡；蔣金花等[25]研究發(fā)現(xiàn)，氰戊菊酯對(duì)斑馬魚(yú)(Daniorerio)仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.40、18.30、4.87 μg/L；譚曉珍等[22]的研究表明，氰戊菊酯對(duì)櫛孔扇貝的96 h半致死質(zhì)量濃度為1.742 mg/L。本試驗(yàn)中，氰戊菊酯對(duì)仿刺參幼參的96 h半致死質(zhì)量濃度為1.189 mg/L，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，氰戊菊酯對(duì)蝦類和魚(yú)類的毒性要遠(yuǎn)大于對(duì)以仿刺參和貝類為代表的無(wú)脊椎動(dòng)物。

3.2 仿刺參幼參死亡狀態(tài)分析

本試驗(yàn)選取了3種實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的擬除蟲(chóng)菊酯作為試驗(yàn)藥物[26]，以海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的代表性經(jīng)濟(jì)物種仿刺參作為受試動(dòng)物。由于生物早期發(fā)育階段是對(duì)藥物脅迫最為敏感的階段，因此本試驗(yàn)選取6月齡的仿刺參幼參作為受試對(duì)象。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，3種擬除蟲(chóng)菊酯類藥物導(dǎo)致幼參死亡后身體均會(huì)呈現(xiàn)僵硬狀態(tài)。擬除蟲(chóng)菊酯類藥物作為一種神經(jīng)毒劑[27]，可作用于神經(jīng)膜鈉離子通道，干擾神經(jīng)傳導(dǎo)[28]，造成肌肉的持續(xù)收縮，推測(cè)這是造成仿刺參幼參死亡后身體呈僵硬狀態(tài)的原因之一。相關(guān)研究表明，擬除蟲(chóng)菊酯類藥物能抑制鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)鰓組織中的Na+/K+-ATP酶活性[29]，從而導(dǎo)致其鰓上皮細(xì)胞脫落死亡等癥狀，這一現(xiàn)象與本試驗(yàn)溴氰菊酯和氯氰菊酯組受試幼參死亡后出現(xiàn)的化皮癥狀相似，而氰戊菊酯試驗(yàn)組中死亡幼參未見(jiàn)明顯化皮。仿刺參幼參對(duì)這3種不同類型擬除蟲(chóng)菊酯的響應(yīng)模式很可能與其致毒作用機(jī)制不同有關(guān)，具體原因有待后續(xù)試驗(yàn)深入研究。

本研究采用的急性毒性試驗(yàn)只能反映藥物對(duì)于受試動(dòng)物死亡情況的影響，無(wú)法全面反映藥物的其他毒性特征，因此需進(jìn)一步開(kāi)展擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參的致毒機(jī)制研究。結(jié)合近年來(lái)黃渤海海岸帶沉積物中的擬除蟲(chóng)菊酯調(diào)查數(shù)據(jù)[8]，對(duì)比本試驗(yàn)結(jié)果中溴氰菊酯和氯氰菊酯的半致死質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)黃渤海沉積物中的2種擬除蟲(chóng)菊酯殘留對(duì)仿刺參幼參暫時(shí)沒(méi)有明顯毒性作用。在自然海水環(huán)境中，其他環(huán)境因素(如重金屬、營(yíng)養(yǎng)鹽)的存在均可能影響擬除蟲(chóng)菊酯藥物的生物毒性，各成分之間可能存在拮抗、疊加或協(xié)同作用，因此擬除蟲(chóng)菊酯與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性有必要進(jìn)一步研究探索。

4 結(jié) 論

(1) 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.110 mg/L(溴氰菊酯)、0.787 mg/L(氯氰菊酯)、1.189 mg/L(氰戊菊酯)。

(2) 3種擬除蟲(chóng)菊酯藥物對(duì)仿刺參幼參的毒性效應(yīng)存在差異，毒性依次為溴氰菊酯>氯氰菊酯>氰戊菊酯。

(3) 3種擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)仿刺參幼參的安全質(zhì)量濃度分別為0.011 mg/L(溴氰菊酯)、0.079 mg/L(氯氰菊酯)、0.119 mg/L(氰戊菊酯)，按照水生生物毒性分級(jí)，溴氰菊酯和氯氰菊酯對(duì)仿刺參幼參為極毒物質(zhì)，氰戊菊酯對(duì)仿刺參幼參為高毒物質(zhì)。