馮向陽 謝君 王宏勛

摘要：鮮切蓮藕因失去外層組織保護而易發(fā)生褐變，而酶促褐變是主要原因。真空包裝對鮮切蓮藕的褐變有較好的延緩作用，其中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）和過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）的編碼基因是參與果蔬褐變的主要基因。但目前關(guān)于真空包裝對鮮切蓮藕片相關(guān)酶活性及其編碼基因表達的影響研究甚少。分析在 4 ℃ 下真空包裝對鮮切蓮藕貯藏過程中褐變度和PPO、POD活性及其編碼基因表達的影響。結(jié)果表明，真空包裝對延緩鮮切蓮藕褐變有較好效果，且在貯藏期內(nèi)真空包裝鮮切蓮藕PPO、POD活性變化與其褐變度大體一致。與此同時，基因NnPPOC和NnPOD4的表達量變化對PPO、POD活性的影響與最終蓬藕的褐變度變化一致，且真空包裝對基因NnPPOA、NnPOD1/2/3的表達呈現(xiàn)出不同程度的抑制效果，說明真空包裝對鮮切蓮藕的NnPPOA/C和NnPOD1/2/3/4基因表達量有降低作用，進而起到延緩褐變的目的。

關(guān)鍵詞：鮮切蓮藕;褐變;酶活性;基因表達

中圖分類號： TS255.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0210-04

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）屬睡蓮科（Nelumbonaceae）多年生宿根性草本植物，是我國特色的水生蔬菜和出口創(chuàng)匯蔬菜，并逐漸成為最受歡迎的蔬菜之一[1-3]。近年來，隨著消費水平的提高和生活方式的變化，鮮切果蔬越來越受關(guān)注，而蓮藕因其具有營養(yǎng)豐富、組織脆嫩等特點逐漸成為鮮切果蔬商品化中重要的一部分[4-5]。然而，鮮切蓮藕在加工貯藏過程中極易發(fā)生酶促褐變，對其品質(zhì)產(chǎn)生不可逆的影響，降低食用價值和縮短貨架期[6-7]，因此，抑制酶促褐變是保持鮮切蓮藕品質(zhì)和延長貨架期的重要途徑。

目前控制鮮切果蔬褐變的方法可以分為保鮮劑（如L-半胱氨酸[8]、二氧化氯[9]、亞硫酸鹽[10]、過氧化氫[11]、抗壞血酸及其衍生物[12]、有機酸[13-14]、螯合劑中的乙二胺四乙酸、植酸[15-16]）處理，以及不同包裝方式（如熱處理[17]、氣調(diào)貯藏[18]、低溫貯藏[19]）處理，其中真空包裝作為保鮮技術(shù)的一種重要方式，通過抽真空來降低空氣壓力，減少包裝中的氧氣含量，從而降低果蔬的呼吸強度并抑制多酚氧化酶的活性，進而延緩鮮切果蔬的褐變進程，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，真空包裝結(jié)合低溫貯藏能有效保持鮮切菠蘿的品質(zhì)，使其褐變度明顯降低[20]。

目前研究報道顯示，PPO和POD基因參與了果蔬褐變進程[21-22]，筆者所在實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，NnPPOA、NnPOD1-6是高溫誘導下鮮切蓮藕褐變的候選基因[19]。但是，關(guān)于真空包裝對鮮切蓮藕中PPO和POD編碼基因的影響研究甚少。因此，本試驗采用在4 ℃下真空包裝方式對在貯藏期內(nèi)鮮切蓮藕的褐變度和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）、過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）活性變化及其編碼基因表達的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶泥蓮藕（品種為武植二號），購于武漢民生金旺果蔬批發(fā)市場;NaH2PO4、Na2HPO4、無水碳酸鈉、丙酮、磷酸、聚乙二醇6000、無水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚氯仿、異戊醇、疏基乙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris、LiCl、NaOH（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;30%過氧化氫（分析純，上海威奧生物科技有限公司）。

cDNA合成試劑盒、Ssofast反應試劑盒（美國Bio-Rad）;Trition X-100（Biosharp生物科技有限公司）;50×TAE（北京百奧萊博科技有限公司）;TaKaRa膠回收試劑盒、E×Tap酶反應試劑盒、DH5α（TaKaRa生物有限公司）;去除DNA試劑盒（美國Thermo）;瓊脂糖凝膠（北京沃比森科技有限公司）;DEPC（Biosharp生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140型電子分析天平[奧賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司];GL-20G-Ⅱ離心機（上海安亭科學儀器廠）;IMS-20雪科制冰機（常熟市雪科電器有限公司）;XHF-D內(nèi)切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）;101-3EB型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海恒一科學儀器有限公司）;HYC-326A醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;A360型紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司];氣調(diào)包裝機成套設(shè)備（上海福帝包裝機械有限公司）;FHW-450型保鮮膜封接機（浙江江南實業(yè)有限公司）;DYCP-31DN電泳儀（北京六一儀器廠）;T100 TM Thermal Cycler PCR儀、CFX96熒光PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理 將購買來的新鮮蓮藕運送到實驗室對其表面淤泥進行清洗，并挑選尺寸和表面顏色均勻且無損傷的蓮藕置于4 ℃下預冷24 h后，使用刀沿著蓮藕的橫截面切成5 mm厚的切片，并將其立即轉(zhuǎn)入清水中浸泡3 min，然后撈出蓮藕切片并用濾紙快速吸干表層水分，分別進行真空包裝和常壓包裝（對照）并轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱中進行為期35 d的貯藏試驗，每盒放置鮮切蓮藕5片，每個處理時間點（貯藏0、7、14、21、28、35 d）設(shè)置3組平行。

1.3.2 褐變度的測定 通過對張京芳的鮮切蓮藕褐變檢測方法[23]進行改進，將存放于4 ℃冰箱內(nèi)2種包裝方式下的蓮藕每隔7 d各取出3盒切碎，并快速稱取3.0 g置于離心瓶中，加入30 mL預冷的雙蒸水，以冰浴的方式高速勻漿20 s后，在4 ℃下以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液 3.5 mL 于10 mL離心管中并在25 ℃水浴鍋中保溫5 min，于410 nm條件下測其吸光度，褐變度表示為D410 nm×10，每個處理3組平行。

1.3.3 PPO和POD活性的測定 按照之前的研究方法對PPO和POD進行提取和活性測定[19，24]。4 ℃下2種包裝方式的蓮藕切片 15 g 于冰浴的研缽中，倒入30 mL保存于 -20 ℃ 條件下的丙酮進行充分研磨后，置于通風櫥中揮發(fā)干燥，稱取1.5 g干燥后的樣品于燒杯中，加入30 mL pH值為7.0的磷酸緩沖液，充分攪拌10 min得到總酶的粗提取液，分別吸取5 mL粗酶液于2組試管中，每組3個平行，在第1組試管中先后加入15 mL pH值為7.0的磷酸緩沖液和 5 mL 鄰苯二酚，搖勻得到PPO提取液，在第2組試管中先后加入5 mL pH值為5.0的醋酸緩沖液和5 mL愈創(chuàng)木酚，搖勻后加入5 mL 0.1%的過氧化氫溶液得到POD提取液，通過分光光度法將PPO、POD活性單位（U）分別定義為在420、470 nm 處1 min引起吸光度改變0.001、0.01所需的酶量。

1.3.4 RNA提取和cDNA合成 根據(jù)現(xiàn)有的文獻提取蓮藕樣品中總RNA[25]，同時將有污染的基因組DNA痕跡從總RNA中去除，以確保檢測的準確性，并使用iScript cDNA合成試劑盒（Bio-Rad）進行相關(guān)cDNA的合成[22]。

1.3.5 實時熒光定量PCR 用于PCR分析的寡核苷酸引物在Min等的研究中已經(jīng)得到驗證[25]，據(jù)此使用Ssofast EvaGreen Supermix試劑盒（Bio-Rad）和CFX96熒光PCR進行實時定量PCR，以對相關(guān)基因的表達情況開展后續(xù)研究[26]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 對所得數(shù)據(jù)進行整理并使用Origin 8.0軟件進行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變度

如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，真空包裝鮮切蓮藕的褐變度（browning degree）僅從初始的0.260增加到0.313，而常壓包裝鮮切蓮藕的褐變度從初始的0.260增加到0.461。且真空包裝下鮮切蓮藕的褐變度明顯低于常壓包裝。因此，該結(jié)果進一步證明真空包裝對鮮切蓮藕的褐變進程有較好的延緩作用[27-28]。

2.2 真空包裝對鮮切蓮藕PPO、POD活性的影響

PPO是參與果蔬褐變最重要的酚酶[29]。如圖2所示，在4 ℃貯藏期內(nèi)，2種包裝方式下鮮切蓮藕的PPO活性呈現(xiàn)明顯不同的增長趨勢，其中真空包裝的PPO活性從處理當天的0.452 U/g增加至貯藏35 d的0.571 U/g，而常壓包裝的PPO活性從處理當天的0.452 U/g增加至貯藏35 d的 1.311 U/g，由此可見，在貯藏期內(nèi)，真空包裝能有效抑制PPO活性的增加。

POD在H2O2存在的條件下促進果蔬褐變的發(fā)生[30-31]。如圖3所示，整個貯藏期內(nèi)2種包裝方式下的鮮切蓮藕POD活性均呈增加趨勢，4 ℃真空包裝下的POD活性從處理當天的0.061 U/g增加到貯藏35 d的0.095 U/g，而4 ℃常壓包裝下的POD活性從處理當0天的0.061 U/g上升到了貯藏35 d的0.144 U/g。貯藏14 d之前，2種包裝方式下POD活性未出現(xiàn)明顯差別，貯藏14 d后真空包裝對POD活性的升高開始產(chǎn)生抑制效果。

根據(jù)相關(guān)研究可知，PPO和POD參與了鮮切蓮藕的酶促褐變[32]。通過分析2種包裝方式對PPO、POD活性變化的影響發(fā)現(xiàn)，在貯藏期內(nèi)，4 ℃真空包裝對鮮切蓮藕的PPO活性的升高產(chǎn)生了明顯的抑制效果，貯藏7 d后，真空包裝對POD活性的增加開始產(chǎn)生抑制作用，由此可以發(fā)現(xiàn)，真空包裝對PPO、POD活性的抑制作用有利于延緩蓮藕褐變度的增加，進而使品質(zhì)得到更好的保持，此結(jié)果與前人研究報道[33-34]相一致。

2.3 鮮切蓮藕褐變相關(guān)基因NnPPO、NnPOD基因表達表達分析

由圖4可知，在真空包裝環(huán)境下，NnPPOC的表達量始終被抑制，而真空包裝在貯藏7 d后開始抑制基因NnPPOA的表達，并在貯藏35 d時基因NnPPOA的表達量最低，與常壓包裝相比，真空包裝對基因NnPPOA的表達在貯藏28 d后產(chǎn)生明顯的抑制作用，且常壓下基因NnPPOA、NnPPOC的表達均被誘導，這與真空包裝下PPO活性明顯低于常壓包裝相吻合。由此可知，真空包裝能通過下調(diào)NnPPOA和NnPPOC的表達來降低PPO活性。

由圖5可知，與對照組相比，真空包裝鮮切蓮藕的NnPOD1、NnPOD2、NnPOD3基因表達量在整個貯藏期內(nèi)始終處于被抑制的狀態(tài)，這與酶活性的變化相吻合。在2種包裝方式的樣品中，NnPOD4和NnPOD5的表達量均呈現(xiàn)不同程度的增加，這可能參與到其他品質(zhì)變化的調(diào)控中，有待于后期的進一步研究。NnPOD7的表達在2種包裝狀態(tài)下整體被抑制，且無明顯差異。與之不同的是，基因NnPOD6的表達被真空明顯誘導。

真空包裝對鮮切蓮藕基因NnPPOC的表達影響與PPO活性變化及蓮藕褐變程度大體同步，且在貯藏7 d后，基因NnPPOA的表達受到真空抑制作用也參與到降低PPO活性和延緩蓮藕褐變進程中;與此同時，在貯藏期內(nèi)，真空包裝對蓮藕基因NnPOD1/2/3的表達始終表現(xiàn)出抑制效果，在貯藏7 d后，基因NnPOD4的表達量開始因受到真空的抑制作用而下降，這與POD活性變化及蓮藕褐變程度相一致。常艷等通過研究發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶基因（PbPPO）是參與碭山酥梨品質(zhì)變化的關(guān)鍵基因[35]。韓艷文等通過不同降溫方式處理采收后的鴨梨發(fā)現(xiàn)，與POD活性相關(guān)基因的表達與鴨梨的褐變度變化和品質(zhì)變化有直接的聯(lián)系[36]。筆者所在實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，高溫下新鮮蓮藕褐變度的增加與NnPPOA、NnPOD1-6基因表達量的上調(diào)有關(guān)[19]。因此，筆者認為，NnPPOA/C和NnPOD1/2/3可能參與了真空包裝下鮮切蓮藕褐變延緩進程，是鮮切蓮藕褐變的重要候選基因。

3 結(jié)論

在4 ℃貯藏期內(nèi)，真空包裝相對于常壓包裝能明顯降低鮮切蓮藕的褐變度，同時發(fā)現(xiàn)，真空包裝鮮切蓮藕的PPO活性均始終低于常壓包裝，POD活性在貯藏7 d后被抑制并逐步低于常壓包裝，這與2種包裝方式下蓮藕褐變度變化情況大體一致。此外，NnPPOA/C和NnPOD1/2/3/4受真空包裝影響均參與了PPO、POD活性變化的調(diào)控過程，且基因NnPPOC、NnPOD4的表達情況分別對PPO、POD活性的影響與最終蓮藕的褐變度變化相吻合。說明真空包裝可能通過下調(diào)NnPPOA/C和NnPOD1/2/3的表達量來延緩鮮切蓮藕褐變進程。

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