么大軒 張彬 劉松濤

摘要：利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱SNP）與簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）2種分子標(biāo)記對(duì)23份甜玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，6對(duì)針對(duì)su1基因的SNP引物分別在 7 790、8 210、10 550 bp位點(diǎn)處檢測(cè)到22、17、23個(gè)自交系發(fā)生突變。23份甜玉米自交系在相似系數(shù)為0.55處被劃分為4個(gè)SNP類群;用19對(duì)針對(duì)玉米10條染色體的SSR引物共檢測(cè)出83個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為4.4個(gè)，在相似系數(shù)為0.55處被劃分為5個(gè)SSP類群。2種分子標(biāo)記在類群劃分中既存在一定的相關(guān)性，也存在一定的差異。用SNP、SSR法檢測(cè)的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.64、0.71，表明23份甜玉米自交系存在比較豐富的遺傳變異，種質(zhì)資源較為豐富。

關(guān)鍵詞：甜玉米;分子標(biāo)記;SNP;SSR;聚類分析

中圖分類號(hào)： S513.032 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0045-05

甜玉米是玉米屬的一個(gè)亞種，起源于美洲大陸，是一種集糧、果、蔬、飼于一體的經(jīng)濟(jì)型作物，人類種植和食用甜玉米已有100多年的歷史[1]。甜玉米鮮穗可直接上市或加工，乳熟時(shí)籽粒中富含蛋白質(zhì)、水溶性多糖、多種游離氨基酸和維生素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、加工價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人們生活水平的提高，甜玉米也迎來(lái)了更多的消費(fèi)者[2]。美國(guó)是世界上開展甜玉米育種研究最早的國(guó)家，早在1828年，美國(guó)人索布就發(fā)表了關(guān)于甜玉米研究的第1篇論文，1836年諾埃斯·達(dá)林培育出了第1個(gè)甜玉米品種達(dá)林早熟[3]。而我國(guó)對(duì)甜玉米的研究起步較晚，直到1968年，才由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出了首個(gè)甜玉米品種北京白砂糖[4]，到了20世紀(jì)80年代，又有一批新品種出現(xiàn)，如農(nóng)梅Ⅰ號(hào)、東甜2號(hào)、金甜1號(hào)、甜玉2號(hào)等，但是其應(yīng)用和推廣面積有限[5-6]。

從20世紀(jì)90年代至今，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高以及甜玉米加工產(chǎn)品的出現(xiàn)，對(duì)甜玉米的需求量與種質(zhì)資源遺傳多樣性的需求不斷提高[7]。但是，由于我國(guó)不是甜玉米的起源中心，很多材料依賴于從美國(guó)、泰國(guó)等海外引進(jìn)，甜玉米的親緣關(guān)系比較近，類型較單一[8]，從而嚴(yán)重影響了我國(guó)甜玉米育種的進(jìn)一步發(fā)展。因此，對(duì)甜玉米的遺傳多樣性進(jìn)行研究尤其重要。

近幾年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，作為新的手段和方法已被用于檢測(cè)玉米的遺傳多樣性，主要包括限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱SNP）等分子標(biāo)記技術(shù)。其中單個(gè)堿基變異的SNP作為第3代分子標(biāo)記，具有密度高、分布廣等優(yōu)勢(shì)，在水稻、玉米等植物性狀標(biāo)記分析、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等方面有廣闊的應(yīng)用前景[9-12]。在玉米上，康奈爾Buckle實(shí)驗(yàn)室和Illumina公司構(gòu)建了高密度的SNP標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，為分子育種提供了可靠的信息。SSR是一類由 1～6個(gè)堿基組成的基因串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，它們廣泛分布于基因組的不同位置[13]。SSR具有多態(tài)性水平高、遺傳方式簡(jiǎn)單、結(jié)果重現(xiàn)性好、穩(wěn)定可靠、需要的DNA量少且操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[14]，被育種研究者們廣泛使用[15-16]。然而，目前利用分子標(biāo)記對(duì)甜玉米進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道還較少。

為了綜合SNP分子標(biāo)記與SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，增強(qiáng)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，同時(shí)探究2種分子標(biāo)記的聯(lián)系與差異，本研究采用SNP、SSR 2種分子標(biāo)記同時(shí)對(duì)23份甜玉米材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，以期為甜玉米育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的23份甜玉米自交系（均為su1甜玉米）和1份常規(guī)對(duì)照自交系由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究室提供，其名稱詳見表1。

SNP檢測(cè)試驗(yàn)所用引物參照韓國(guó)Shin等研究設(shè)計(jì)的6對(duì)SNP引物[17]，詳見表2。SSR檢測(cè)試驗(yàn)所用引物參照CIMMYT（國(guó)際玉米小麥改良中心）公布的針對(duì)玉米10條染色體的核心引物，從中篩選出19對(duì)帶型清晰、穩(wěn)定性好的引物進(jìn)行SSR分析，相應(yīng)的引物序列見表3。以上引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于2015年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)種子科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，甜玉米材料種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三分廠試驗(yàn)田。取0.5 g甜玉米鮮葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB）法對(duì)供試的23份甜玉米進(jìn)行DNA提取，并用NanoDrop ND1000型紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA分子D260 nm/D280 nm及濃度，之后統(tǒng)一將濃度稀釋至100 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)體系和條件

20 μL PCR反應(yīng)體系：2 μL 10×Taq 緩沖液（含Mg2+）、1.6 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1 μL前引物、1 μL后引物、0.2 μL Taq酶（2.5 U/L）、1 μL DNA模板（100 ng/μL）、13.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 變性 30 s，X ℃退火[X=（前引物Tm+后引物Tm）/2-1，Tm為理論退火溫度]45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳 在每個(gè)PCR體系中加入5 μL加樣緩沖液6×loading buffer，取10 μL上樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，于180 V、300 mA、80 W電泳15 min，用EB（溴化乙錠）顯色，用BioRAD凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，記錄條帶信息。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 在每個(gè)PCR體系中加入5 μL加樣緩沖液6×loading buffer，取2 μL上樣于6%聚丙烯酰胺凝膠上，于300 V、200 mA、100 W電泳45 min，用銀染法顯影，將膠置于燈箱上觀察拍照，記錄條帶信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析方法

根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果讀取條帶，同一長(zhǎng)度處有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，缺失的記為9，用NTSYS Version 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

用6對(duì)針對(duì)su1基因設(shè)計(jì)的SNP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中在1～23號(hào)供試甜玉米中均能檢測(cè)到點(diǎn)突變，而對(duì)照常規(guī)玉米自交系Mo17在所檢測(cè)的3個(gè)變異位點(diǎn)上均無(wú)擴(kuò)增條帶，即在檢測(cè)的3個(gè)位點(diǎn)上均無(wú)變異，8210（A/G）位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果見圖1。

由表4可以看出，在7790位點(diǎn)處，有22個(gè)自交系發(fā)生突變，116327、116329、116353等15個(gè)自交系發(fā)生C堿基突變，116359-60、 116377、116432等7個(gè)自交系發(fā)生T堿基突變。

在829位點(diǎn)處，有17個(gè)自交系發(fā)生突變，116327、116377-78、116390等8個(gè)自交系發(fā)生A堿基突變，116432、116471、116484等9個(gè)自交系發(fā)生G堿基突變。在10550位點(diǎn)處，23個(gè)自交系全部發(fā)生突變，116432、116455、116471等5個(gè)自交系發(fā)生G堿基突變，116469、116379、116385等18個(gè)自交系發(fā)生A堿基突變。

通過對(duì)10條染色體的核心引物進(jìn)行篩選，獲得19個(gè)條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物。利用篩選出的引物對(duì)供試的23份甜玉米材料進(jìn)行DNA擴(kuò)增，其中引物bnlg439的擴(kuò)增條帶如圖2所示。對(duì)全部擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的條帶數(shù)在4～11條之間，19對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出114條條帶，其中多態(tài)性條帶83條，平均每對(duì)引物檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)為4.4個(gè)，多態(tài)性條帶數(shù)占總條帶數(shù)的73%。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)2種分子標(biāo)記結(jié)果，計(jì)算23份甜玉米的遺傳相似系數(shù)，其中SNP相似系數(shù)為0.28～1.00，平均遺傳相似系數(shù)為0.64;SSR遺傳相似系數(shù)為0.47～0.95，平均遺傳相似系數(shù)為0.71。由此可見，2種標(biāo)記方法的平均遺傳相似系數(shù)基本一致，說明含有su1基因的甜玉米突變體的遺傳背景存在比較豐富的遺傳變異。

2.3 聚類分析

當(dāng)相似系數(shù)為0.55時(shí)，23份甜玉米材料被劃分為4個(gè)SNP類群（SNP groups，簡(jiǎn)稱SNPGs），分別為SNPGⅠ、SNPGⅡ、SNPGⅢ和SNPGⅣ（圖3）。由表4可以看出，SNPG Ⅰ包含116327、116390、紫su5-3、紫su5-12、紫su5-3-3、116377-78、116385、黃su7-8、116375、116329、116353、116379、116394、116424共14份材料，占60.9%;SNPG Ⅱ僅含有1份材料，即116455，占4.3%;SNPG Ⅲ、SNPG Ⅳ各含有4份材料，分別為116359-60、116377、紅su5、116469和116432、116471、116485、116484，各占供試材料的17.4%。

由圖4的SSR標(biāo)記聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相似系數(shù)為0.55時(shí)，23份甜玉米自交系被分為5個(gè)類群（SSR groups，簡(jiǎn)稱SSRGs）。其中SSRGⅠ包括紫su5-3、紫su5-12、黃su7-8、116390、116329、116375、紫su5-3-3等13份材料;SSRGⅡ和SSRGⅣ分別包含116359-60、116394、116424和 116377-78、116469、116471;SSRGⅢ和SSRGⅤ分別包含116484、116485和116432、116455（表5）。

3 討論

玉米胚乳基因組內(nèi)某一特定核苷酸位置發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛倒、插入、缺失等都有可能使其突變?yōu)樘鹩衩?。su突變體編碼的蛋白質(zhì)，即異淀粉酶是淀粉去分支酶的一種[18-19]，能使糖向淀粉的轉(zhuǎn)化過程受阻，造成中間產(chǎn)物大量積累，因而發(fā)生相應(yīng)突變的玉米中的蔗糖、還原糖含量顯著高于普通玉米，使玉米未成熟籽粒中大量積累水溶性多糖[20-21]。

本試驗(yàn)應(yīng)用SNP、SSR 2種分子標(biāo)記研究su1型甜玉米。su1基因位于第4染色體的第8～66位點(diǎn)，在該位點(diǎn)先后發(fā)現(xiàn)了sul-am、sul-B n2、sul-cr、sul-st和sul-R等等位基因[1]。本試驗(yàn)選用等位基因特異性PCR對(duì)su1基因的7790、8210及10550這3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，該方法具有成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但仍需要對(duì)引物退火溫度以及反應(yīng)條件進(jìn)行一定的摸索。有報(bào)道指出，等位基因特異PCR反應(yīng)體系具有很高的靈敏性[22]，然而試驗(yàn)中依然會(huì)有隱約的非特異性條帶出現(xiàn)，本試驗(yàn)中檢測(cè)的甜玉米在7790、8210、10550這3個(gè)突變位點(diǎn)中至少存在1～2個(gè)突變，PCR反應(yīng)對(duì)退火和延伸過程的時(shí)間和溫度比較敏感[17]，因而不適宜的反應(yīng)條件可能會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，使得堿基發(fā)生非特異性結(jié)合。本試驗(yàn)通過適當(dāng)提高退火溫度，較大程度地抑制了非特異性條帶的產(chǎn)生，與樂素菊等的研究結(jié)果[23]一致。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是近10年來(lái)常用的研究遺傳多樣性的方法[24]。趙波等利用SSR標(biāo)記，對(duì)小豆種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，檢測(cè)到86個(gè)等位變異[25]。陳婧等曾利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米進(jìn)行了遺傳多樣性分析[26-28]。胡萍等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州的108份玉米品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，得出其遺傳相似系數(shù)在0.44～0.99之間[29]。王利峰等利用表型和SSR分析了河南省玉米的遺傳多樣性，得出其遺傳相似系數(shù)為0.63～0.89[30]。而本試驗(yàn)利用19對(duì)SSR引物對(duì)23份甜玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)出80個(gè)等位基因有變異位點(diǎn)，檢測(cè)到的等位基因數(shù)為4.4個(gè)，遺傳相似度系數(shù)為0.47～0.95，表明甜玉米種質(zhì)來(lái)源較廣泛，遺傳基礎(chǔ)豐富。本研究將供試材料劃分為5大類，從分子水平分析了甜玉米的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多態(tài)性水平，為研究親本選配、新種質(zhì)創(chuàng)制等提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)利用SNP、SSR 2種分子標(biāo)記，研究了甜玉米的遺傳多樣性，在甜玉米親緣劃分上，2種分子標(biāo)記存在一定的相關(guān)性，均能將紫su5-3、紫su5-12和紫su5-3-3等姊妹系聚在一起，同時(shí)也存在一定的差異，如SSR標(biāo)記比SNP標(biāo)記劃分的類群多1個(gè)。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了用分子標(biāo)記探究種質(zhì)資源血緣關(guān)系的科學(xué)性、準(zhǔn)確性，由于引物數(shù)量及試驗(yàn)材料數(shù)量的限制，要得到更精確的群體結(jié)構(gòu)劃分還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]姚文華，韓學(xué)莉，汪燕芬，等. 我國(guó)甜玉米育種研究現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2011，13（2）：1-8.

[2]趙久然，滕海濤，張麗萍，等. 國(guó)內(nèi)外甜玉米產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 玉米科學(xué)，2003（?？?8-100.

[3]曾孟潛，劉雅楠，楊濤蘭，等. 甜玉米、筍玉米的起源與遺傳[J]. 遺傳，1999，21（3）：44-45.

[4]李小琴，吳景強(qiáng)，葉翠玉，等. 我國(guó)甜玉米育種概況及面臨的挑戰(zhàn)[J]. 作物雜志，2002（5）：45-46.

[5]吳燕麗. 廣東省鮮食玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對(duì)策研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6]石德權(quán)，郭慶法，汪黎明，等. 我國(guó)玉米品質(zhì)現(xiàn)狀、問題及發(fā)展優(yōu)質(zhì)食用玉米對(duì)策[J]. 玉米科學(xué)，2001（2）：3-7.

[7]番興明，張世煌，譚 靜，等. 根據(jù)SSR標(biāo)記劃分優(yōu)質(zhì)蛋白玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)群[J]. 作物學(xué)報(bào)，2003，29（1）：105-110.

[8]戴惠學(xué)，陸作楣. 甜玉米二環(huán)系選育的早代判別法研究[J]. 種子，2006，25（5）：30-34.

[9]Rafalski A. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics[J]. Current Opinion in Plant Biology，2002，5（2）：94-100.

[10]Jones E S，Sullivan H，Bhattramakki D，et al. A comparison of simple sequence repeat and single nucleotide polymorphism marker technologies for the genotypic analysis of maize（Zea mays L.）[J]. Theor Appl Genet，2007，115（3）：361-371.

[11]Varshney R K，Thiel T，Sretenovic-Rajicic T，et al. Identification andvalidation of a core set of informative genic SSR and SNP markers forassaying functional diversity in barley[J]. Mol Breeding，2008，22（1）：1-13.

[12]Pindo M，Vezzulli S，Coppola G，et al. SNP high-throughput screening in grapevine using the SNPlexTM genotyping system[J]. BMC Plant Biology，2008，8：12-17.

[13]曹永國(guó). SSR標(biāo)記在玉米雜種優(yōu)勢(shì)及遺傳圖譜中的應(yīng)用研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2000.

[14]Barcaccia G，Lucchin M，Parrini P. Characterization of a flint maize （Zea mays var. indurate） Italian landrace：Ⅱ. Genetic diversity and relatedness assessed by SSR and Inter-SSR molecular markers. Genetic Resource and Crop Evolution，2003，50：253-271.

[15]Yao Q L，Yang K C，Pan G T，Rong T Z. Genetic diversity of maize （Zea may L.） landraces from southwest China base on SSR data[J]. Journal of Genetics and Genomics，2007，34（9）：851-860.

[16]Liu Z Z，Guo R H，Zhao J R，et al. Population structure and genetic diversity of maize landraces from the southwest maize region of China[J]. Maydica，2009，54（1）：63-76.

[17]Shin J H，Kwon S J，Lee J K，et al. Genetic diversity of maize kernel starch-synthesis genes with SNAPs[J]. Genome，2006，49（10）：1287-1296.

[18]王虎義. 玉米胚乳突變體Su5遺傳分析和基因定位[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2012.

[19]楊泉女，王蘊(yùn)波. 甜玉米胚乳突變基因的研究進(jìn)展及其在育種中應(yīng)用的策略[J]. 分子植物育種，2005，3（6）：125-130.

[20]李學(xué)淵，劉紀(jì)麟. 玉米胚乳突變基因與互作對(duì)籽粒成份的影響Ⅲ. su1基因與sh2、bt2基因的互作效應(yīng)及其利用價(jià)值[J]. 作物學(xué)報(bào)，1993，19（6）：509-514.

[21]East E M，Hayes H K. Inheritance in maize[J]. Conn Agric Exp Stn Bull，1911，167：1-142.

[22]Bottema C D K，Sarkar G，Cassay J D，et al. PCR-amplification of specific alleles：a general method of rapidly detecting mutations，polymorphisms and haplotypes[J]. Meth Enzymol，1993，288（1）：388-402.

[23]樂素菊，劉鵬飛，曾慕衡，等. 超甜玉米bt2基因SNP位點(diǎn)的分析及分子標(biāo)記輔助篩選[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（11）：73-78.

[24]江云珠. 中國(guó)稻種資源同工酶和SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002.

[25]趙 波，葉 劍，金文林，等. 不同類型小豆種質(zhì)SSR標(biāo)記遺傳多樣性及性狀關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（4）：673-682.

[26]陳 婧，李建平. 西北地區(qū)糯玉米自交系遺傳多樣性研究[J]. 玉米科學(xué)，2014，22（3）：29-35.

[27]王鳳格，田紅麗，趙久然，等. 中國(guó)328個(gè)玉米品種（組合）SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（5）：856-864.

[28]李齊向，張小中，涂前程，等. 基于SSR分子標(biāo)記的青貯玉米自交系遺傳多樣性分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，28（4）：320-323.

[29]胡 萍，楊恩瓊，施文娟，等. 貴州108份地方玉米品種的SSR遺傳多樣性分析[J]. 種子，2012，9（9）：61-65，68.

[30]王利鋒，李會(huì)勇，唐保軍，等. 利用表型和SSR標(biāo)記分析河南省玉米地方品種的遺傳多樣性[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（4）：1136-1144.溫書香，安利民，趙 協(xié)，等. 豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：50-53.