何占娣，劉迎娣

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）包括單純性脂肪肝（simple fatty liver, SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化[1-2]。NAFLD的患病率呈逐年上升趨勢，NAFLD患者占全球總?cè)丝诘?5%～45%[1-2]，在肥胖癥、糖尿病或代謝綜合征人群中，NAFLD的患病率高達(dá)70%～90%[1-2]。目前，該病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病之一。有報(bào)道稱 NAFLD相關(guān)的肝硬化仍無有效的治療措施，肝移植是其最終選擇[1]。故探究NAFLD的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療潛在靶點(diǎn)成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種小的非編碼RNA，大小約為20～25個(gè)核苷酸，與信使RNA（messenger RNA, mRNA）靶向結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，進(jìn)而抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[3]。miRNA參與了人體內(nèi)幾乎所有的生理和病理過程，包括細(xì)胞的分化和增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥和免疫反應(yīng)、物質(zhì)代謝、病毒宿主相互作用以及腫瘤的發(fā)生[3]。miRNA可能是某些疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要節(jié)點(diǎn)，也可能是診斷這些疾病的潛在標(biāo)志物以及治療的潛在靶點(diǎn)[3]。在過去的20年中，miRNA在肝臟炎癥、纖維化和硬化中扮演的角色已經(jīng)被廣泛描述[4]。本文就miRNA在NAFLD中的異常表達(dá)情況、致病作用、潛在的臨床應(yīng)用以及有待解決的問題作一綜述。

1 miRNA參與NAFLD的發(fā)病過程

與健康對照者相比，NAFLD患者體內(nèi)多種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)異常（上調(diào)或下調(diào)），詳見表1。當(dāng)miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)時(shí)，其對靶點(diǎn)蛋白合成的抑制作用增強(qiáng)或減弱，導(dǎo)致靶點(diǎn)蛋白的合成減少或增加，若靶點(diǎn)蛋白恰好又參與肝臟脂肪代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，則會(huì)引起肝臟脂肪代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生。

2 miRNA在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用

在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中，SFL向NASH、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化發(fā)展的潛在機(jī)制均未完全闡明。傳統(tǒng)的“二次打擊”學(xué)說已獲得廣泛認(rèn)可?！暗谝淮未驌簟敝饕欠逝职Y、糖尿病、代謝綜合征等伴隨的胰島素抵抗，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過量沉積；“第二次打擊”是脂肪過量沉積的肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體功能障礙，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放，肝星狀細(xì)胞激活，進(jìn)而引起肝細(xì)胞損傷、肝臟炎癥和纖維化[29]。近年來，隨著與NAFLD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的因素越來越多地被發(fā)現(xiàn)，“二次打擊”學(xué)說已被“多次打擊”學(xué)說所取代[29]?！岸啻未驌簟卑ㄒ葝u素抵抗、脂肪組織功能障礙、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、飲食因素、鐵超載、腸道微生態(tài)失衡、慢性炎癥狀態(tài)以及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)因素。在表觀遺傳學(xué)因素中，又以對miRNA的研究最為深入。以下是在NAFLD發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的相關(guān)miRNA的總結(jié)。

表1 NAFLD中表達(dá)異常的miRNATable 1 Abnormal expression of miRNA in NAFLD

2.1 miRNA-34a 研究發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠模型和NAFLD患者的肝組織和血清中miRNA-34a表達(dá)均上調(diào)（見表1）。miRNA-34a的主要靶點(diǎn)蛋白是Sirtuin 1（SIRT1），SIRT1通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptors α, PPARα）和肝臟X受體（liver X receptor, LXR），或者抑制PPARγ的共激活物1a、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP1c）和法尼醇X受體（farnesoid X receptor, FXR）等轉(zhuǎn)錄因子維持脂代謝平衡。NAFLD患者miRNA-34a表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致SIRT1合成減少[31]，而抑制miRNA-34a表達(dá)則能恢復(fù)SIRT1的合成，從而激活腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK）和PPARα，促進(jìn)脂肪的分解代謝。

2.2 miRNA-122 miRNA-122是肝臟中最豐富的miRNA，在肝臟生理和脂肪代謝中發(fā)揮重要作用[32]。miRNA-122可與人體內(nèi)多種重要的脂肪代謝酶相互作用，比如乙酰輔酶A羧化酶2（acetyl co-enzyme A carboxylase 2, ACC2）和 SREBP[33]。與健康對照者相比，NAFLD患者肝組織miRNA-122表達(dá)下調(diào)[9]，血清miRNA-122表達(dá)上調(diào)[9]。盡管結(jié)果相反，但miRNA-122與NAFLD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系已得到確切的證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)抑制NAFLD小鼠模型miRNA-122表達(dá)可以減輕肝臟脂肪變性，降低血漿膽固醇水平，這與降低肝臟甾醇和脂肪酸合成速率以及激活A(yù)MPK介導(dǎo)的脂肪分解代謝有關(guān)[34]。此外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還證實(shí)miRNA-122通過靶向脯氨酸4-羥化酶亞基α1調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞增殖及膠原蛋白合成[35]，進(jìn)而引起肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

2.3 miRNA-155 在NAFLD患者中，促進(jìn)脂肪合成的因子如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）、C/EBPβ、PPARγ和LXRα[36]，促進(jìn)纖維化的因子如血小板衍生生長因子、SMAD3和C/EBPβ[37]，抑制腫瘤的因子如細(xì)胞因子信號抑制因子1均可引起miRNA-155表達(dá)異常[38]。在NAFLD動(dòng)物模型中，則呈現(xiàn)出相互矛盾的結(jié)果。例如，高脂飲食飼喂miRNA-155表達(dá)缺陷小鼠模型出現(xiàn)肝臟脂肪變性加重[38]，而蛋氨酸-膽堿缺乏飲食飼喂miRNA-155基因敲除小鼠模型則出現(xiàn)肝臟脂肪變性減輕，而且不伴有肝臟損傷或炎癥[37]。這些結(jié)果提示，miRNA-155在肝病患者中可能發(fā)揮不同的作用[37]。

3 miRNA在NAFLD診斷中的作用

如表1所示，與健康對照者相比，NAFLD患者血清或肝組織的多種miRNA表達(dá)異常（上調(diào)或下調(diào)）。此外，不同階段的NAFLD患者（包括SFL、NASH、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化），血清或肝組織miRNA的表達(dá)水平也是不同的。因此，這些表達(dá)異常的miRNA可以作為NAFLD診斷和分期的潛在生物標(biāo)志物。

3.1 miRNA-34a 多項(xiàng)研究表明，與健康對照者相比，NAFLD患者血清和肝組織miRNA-34a表達(dá)上調(diào)[33]。此外，不同階段的NAFLD患者，血清miRNA-34a表達(dá)水平也不同，miRNA-34a表達(dá)水平與血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟脂肪變性程度、炎癥活動(dòng)度分級和纖維化分期均呈現(xiàn)正相關(guān)[33]。

3.2 miRNA-122 與miRNA-34a相似，miRNA-122也被證明有可作為NAFLD診斷和分期生物標(biāo)志物的潛力。與健康對照者相比，NAFLD患者血清miRNA-122水平升高[33]，遠(yuǎn)早于血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高的時(shí)間[39]。此外，miRNA-122作為生物標(biāo)志物也可以擴(kuò)展應(yīng)用到NAFLD的分期中[9]。

3.3 miRNA-192 NAFLD小鼠模型血清miRNA-192水平與NAFLD特征性病理改變的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[40]。另外，與健康對照者相比，NAFLD患者血清miRNA-192表達(dá)上調(diào)已被證實(shí)[9]。此外，還有研究表明，血清miRNA-122和miRNA-192的水平呈現(xiàn)高度正相關(guān)[9]。

3.4 miRNA組合 除對單個(gè)miRNA的檢測，對多個(gè)miRNA的聯(lián)合檢測（包含miRNA-122-5p、miRNA-1290、miRNA-27b-3p和 miRNA-192-5p）在NAFLD診斷方面顯示出更高的準(zhǔn)確性[12]。此外，另一聯(lián)合檢測（包含miRNA-122、miRNA-192、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-125b和miRNA-375）也有較高的準(zhǔn)確性[9]。

4 miRNA在NAFLD治療中的作用

如前所述，miRNA在NAFLD發(fā)生、發(fā)展的不同階段（從SFL到NASH、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化）均發(fā)揮重要作用，因此也成為NAFLD治療的潛在靶點(diǎn)[41]。基于miRNA的治療方案已經(jīng)在NAFLD動(dòng)物模型中廣泛開展，療效確切的方案甚至已經(jīng)進(jìn)入到臨床試驗(yàn)階段。

4.1 miRNA-34a miRNA-34a的拮抗劑circRNA_0046366能夠抑制miRNA-34a的活性，使PPARα信號通路恢復(fù)正常，應(yīng)用于NAFLD小鼠模型后，肝臟脂肪變性獲得改善[42]。而另一項(xiàng)將miRNA-34的模擬物（MRX34）用于原發(fā)性肝癌治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（ClinicalTrials.gov注冊號：NCT01829971）卻由于嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件而提前終止[43]。

4.2 miRNA-103和miRNA-107 在肥胖小鼠模型中，miRNA-103和miRNA-107表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用miRNA-103/miRNA-107的拮抗劑，能夠使靶點(diǎn)蛋白caveolin1（胰島素受體的關(guān)鍵介質(zhì)）的合成恢復(fù)正常，減輕胰島素抵抗[19]。但是，另有兩項(xiàng)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)（ClinicalTrials.gov注冊號：NCT02826525和NCT02612662）顯示，Regulus公司開發(fā)的治療NAFLD和2型糖尿病的miRNA-103/miRNA-107拮抗劑（RG-125/AZD4076）療效并不令人滿意[43]。

4.3 miRNA-122 miRNA-122也是NAFLD治療的潛在靶點(diǎn)。miRNA-122在肝組織中高度表達(dá)，在肝臟的發(fā)育、分化過程中扮演重要角色[44]。過表達(dá)miRNA-122可以抑制YY1-FXR-SHP調(diào)節(jié)軸，減少肝內(nèi)甘油三酯的合成[44]。但是，miRNA-122也是HCV復(fù)制的重要因子，過表達(dá)miRNA-122治療脂肪肝的同時(shí)，也促進(jìn)了HCV的復(fù)制[45]。

5 尚待解決的問題

隨著研究的不斷拓展，NAFLD中表達(dá)異常的miRNA越來越多地被發(fā)現(xiàn)，其影響人體脂肪代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制越來越清楚，基于miRNA的診斷試劑和治療藥物正在開發(fā)當(dāng)中。但是，miRNA代表了一種基因表達(dá)調(diào)控的新方法，與其他新方法類似，在臨床應(yīng)用之前，首先要解決該方法本身存在的一些問題。

5.1 miRNA下游的靶點(diǎn)不具有惟一性 miRNA下游的靶點(diǎn)不是惟一的，單個(gè)miRNA可以調(diào)控幾十個(gè)甚至數(shù)百個(gè)基因表達(dá)[4]。調(diào)節(jié)某個(gè)miRNA的表達(dá)會(huì)影響下游多個(gè)靶點(diǎn)蛋白的合成，這些靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)效應(yīng)可能是相互抵消的，最終顯示不出療效[43]。即使這些效應(yīng)沒有相互抵消，其中一些效應(yīng)確實(shí)是我們需要的，但另一些效應(yīng)也可能是對機(jī)體有害的。

5.2 miRNA對下游靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)具有相互性 在疾病的發(fā)病過程中，miRNA與靶點(diǎn)之間經(jīng)常存在相互調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，我們稱之為“反饋環(huán)”。例如，miRNA-17-5p可以靶向翻譯PPARα的mRNA，抑制其合成。反過來，PPARα可以結(jié)合miRNA-17-5p的啟動(dòng)子，促進(jìn)其表達(dá)。通過人工干預(yù)過表達(dá)miRNA-17-5p，雖然能使PPARα合成減少，但反過來也會(huì)使自身的表達(dá)下調(diào)[46]。

5.3 miRNA藥物不具器官/細(xì)胞靶向性 動(dòng)物模型研究表明靜脈注射miRNA模擬物/抑制劑是一種有價(jià)值的療法。但是，這些小分子藥物進(jìn)入機(jī)體后，并不會(huì)靶向特定的器官/細(xì)胞，在修復(fù)靶器官/細(xì)胞功能的同時(shí)，也會(huì)對正常的器官/細(xì)胞造成損傷。此外，這些小分子藥物如果未經(jīng)適當(dāng)?shù)男揎?，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，造成廣泛的免疫損傷[43]。

5.4 miRNA藥物的理化性狀具有不穩(wěn)定性 miRNA的模擬物/抑制劑均為小分子物質(zhì)，大小約為20～25個(gè)核苷酸，需要在超低溫環(huán)境中才能保持正常的理化性狀和生物學(xué)功能。脫離了超低溫環(huán)境后，其理化性狀是不穩(wěn)定的，很容易在短時(shí)間內(nèi)降解，失去生物學(xué)功能。如何提高miRNA藥物穩(wěn)定性，使其能夠在常規(guī)條件下長期儲(chǔ)存，是有待解決的一大難題[43]。

6 小 結(jié)

近年來，有大量的研究關(guān)注了miRNA在不同階段NAFLD中發(fā)揮的作用。這些研究包括應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，應(yīng)用下一代測序技術(shù)的動(dòng)物模型和人體標(biāo)本數(shù)據(jù)，以及應(yīng)用原位雜交和傳感器技術(shù)的細(xì)胞表型數(shù)據(jù)。基于這些研究，本文綜述了miRNA在NAFLD中的表達(dá)異常、致病作用、潛在的臨床應(yīng)用以及尚待解決的問題。miRNA在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)得到了充分的證實(shí)，因此，其作為NAFLD診斷的生物標(biāo)志物或治療的潛在靶點(diǎn)是有根據(jù)的。由于miRNA表達(dá)異常只是NAFLD等慢性多因素疾病的致病因素之一，因此，大多數(shù)miRNA的調(diào)節(jié)作用也是有限的。實(shí)際上，多數(shù)miRNA僅在疾病的發(fā)病過程中扮演著“精密調(diào)諧器”的角色。此外，它們也缺乏器官/細(xì)胞特異性。盡管如此，許多研究人員相信，只要不斷提高對它們在相關(guān)疾病中所扮演角色的認(rèn)知，miRNA終將會(huì)給這些疾病的治療帶來新的希望。