葉瑞，胡煒，劉炳煒，席紹松，朱英，未亞平

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州，310053；2.浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 重癥監(jiān)護室，浙江 杭州，310006）

膿毒癥是由于感染的宿主反應失控誘發(fā)致命性器官功能障礙，是導致重癥監(jiān)護室（ICU）患者死亡的主要病因，病死率＞40%[1]。膿毒癥的發(fā)病機制較為復雜，目前普遍認為與全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）/ 代償性抗炎反應綜合征（compensatory antiinflammatory response syndrome,CARS）及免疫失衡有關[2]。膿毒癥作為一種炎癥應激性疾病，促炎/抗炎反應異常參與其病理生理進程，這也是誘發(fā)、增強及放大疾病病理生理變化進程的關鍵，同時也將影響機體免疫平衡[3]。T 淋巴細胞參與機體免疫調節(jié)、免疫應答、全身炎癥反應等過程，在免疫穩(wěn)態(tài)和SIRS/CARS 的維持中具有重要作用[4]。目前，關于膿毒癥患者病情變化過程中T 淋巴細胞亞群及炎癥因子的變化特點尚未完全闡明，兩者間的具體關系及對預后的影響仍不明確。本研究動態(tài)監(jiān)測了膿毒癥患者的T 淋巴細胞亞群及血清炎癥因子水平變化，并分析兩者之間的關系，旨在探討免疫紊亂及炎癥反應在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中的演變規(guī)律，為臨床干預治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月—2018年10月浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院ICU 收治的膿毒癥患者126 例作為觀察組，根據病情程度分為膿毒癥組、嚴重膿毒癥組與膿毒癥休克組，并根據隨訪28 d 生存情況分為存活組與死亡組。納入標準：①符合2016年膿毒癥國際會議診斷標準[5]；②發(fā)病24 h 內入院；③年齡＞18 歲；④首次入住ICU。排除標準：①既往存在心、腦、肝、肺、腎等重要臟器功能不全或嚴重原發(fā)病者；②具有惡性腫瘤、變態(tài)反應性疾病、免疫缺陷型疾病、自身免疫性疾病者、再生障礙性貧血病史者；③近6 個月內接受放療、化療、激素或免疫抑制劑治療者；④入住ICU 病房后24 h 內臨床檢測指標不全者；⑤入住ICU 病房時即出現呼吸停止或心跳停止者；⑥入住ICU 病房24 h 內死亡者；⑦處于妊娠期或哺乳期女性。另選同期健康體檢，且性別、年齡相匹配的志愿者60 例作為對照組。研究設計獲本院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有受試對象知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 患者在入住ICU 病房24 h 內完成基本資料收集，包括年齡、性別、細菌培養(yǎng)情況、感染部位等。檢測外周血T 淋巴細胞亞群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）和炎癥因子[ 白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box protein-1,HMGB-1）]。

1.2.2 檢測方法 膿毒癥患者分別在就診時、住院6 h，以及第1、3 和7 天采集外周血，對照組均在體檢當天采血，均采集晨間空腹靜脈血6 ml，分為2 份，一份于4℃下以1 000 r/min 離心10 min，留取血清標本于EP管中置入-80℃冰箱冷凍保存待測，采用潘氏法測定血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR），采用雙抗夾心免疫發(fā)光法測定降鈣素原（Procalcitonin,PCT），采用散射免疫比濁法檢測C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α，ELISA 試劑盒購自美國 Beckman 公司；另一份分離單個核細胞，采用美國Biolegend 公司生產的流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）。操作嚴格按試劑說明書及實驗室規(guī)程執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗、單因素方差分析及重復測量設計的方差分析，計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗和確切概率法（Monte Carlo 法），相關性分析用Pearson 相關性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

觀察組126 例患者中，男性75 例（59.52%），女性51 例（40.48%）；年齡45～85 歲，平均（60.23± 10.44）歲；嚴重程度：63 例膿毒癥，39 例嚴重膿毒癥，24 例膿毒性休克；感染部位：68 例（53.97%）肺部感染，34 例（26.98%）腹腔感染（膽管炎、腹膜炎），19 例（15.08%）尿路感染，5 例（3.97%）其他（胃腸道感染、中樞神經系統(tǒng)感染）（見表1）。觀察組與對照組的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（年齡：t=0.753，P =0.452；性別：χ2=0.257，P =0.612）。觀察組不同嚴重程度膿毒癥患者的年齡、性別、細菌培養(yǎng)陽性及感染部位比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 入院時觀察組與對照組T 淋巴細胞比較

入院時，觀察組的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組CD8+較對照組升高，而CD4+、CD4+/CD8+較對照組降低。見表2。

2.3 入院時觀察組與對照組血清炎癥因子比較

入院時，觀察組的ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α、IL-10、HMGB-1 與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組較對照組升高。見表3。

表1 不同嚴重程度膿毒癥患者一般資料的比較

表2 兩組T 淋巴細胞比較（±s）

表2 兩組T 淋巴細胞比較（±s）

組別 n CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組 60 46.12±3.31 26.22±2.41 1.76±0.23觀察組 126 35.21±2.64 29.13±3.34 1.21±0.15 t 值 24.219 6.038 19.526 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 不同程度膿毒癥患者T 淋巴細胞動態(tài)變化

不同程度膿毒癥不同時間點CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不 同時間點的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，差異有統(tǒng) 計學意義（F=13.312、6.711 和10.259，P=0.000、0.033 和0.012）；②組間CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，差異 均有統(tǒng)計學意義（F=15.694、9.213 和12.206，P=0.000、0.011 和0.000）；③組間CD4+、CD8+、CD4+/CD8+變化 趨勢差異均有統(tǒng)計學意義（F=16.031、10.415 和14.612，P=0.000、0.008 和0.000）。見表4。

2.5 不同程度膿毒癥患者血清炎癥因子動態(tài)變化

不同程度膿毒癥患者不同時間點ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB-1 比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 差異均有統(tǒng)計學意 義（F=6.779、22.165、16.731、9.182 和6.637，P= 0.032、0.000、0.000、0.0016 和0.033），而HMGB-1 水平僅在入院7 d 時呈升高趨勢（F=6.173，P =0.041），在其余各時間點無差異（P＞0.05）；②組間PCT、CRP、IL-6、Il-10、TNF-α 比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 7.012、18.312、14.011、8.231 和5.967，P=0.028、0.000、0.000、0.019 和0.041），但不同亞組間ESR 僅在入院第3 和7天時有差異（F=6.741 和6.717，P=0.036和0.039），HMGB-1 水平僅在入院第7 天時有差異（F=5.796，P =0.044）；③組間ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB-1 變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.512、0.781、23.451、18.226、11.403、7.719 和8.831，P=0.036、0.028、0.000、0.000、0.000、0.027 和0.016）。見表5。

表3 入院時兩組血清炎癥因子比較（±s）

表3 入院時兩組血清炎癥因子比較（±s）

組別 n ESR/（mm/h） PCT/（ng/ml） CRP/（mg/L） IL-6/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml） IL-10/（pg/ml） HMGB-1/（pg/ml）對照組 60 18.43±3.96 0.48±0.15 3.78±1.02 17.12±6.14 13.85±3.43 8.26±2.31 42.21±5.96觀察組 126 30.32±9.31 5.56±1.19 72.01±10.45 60.94±15.21 37.21±9.95 45.83±11.26 62.02±18.31 t 值 9.482 6.994 50.390 21.474 17.671 25.556 8.167 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同程度膿毒癥患者T 淋巴細胞動態(tài)變化（±s）

表4 不同程度膿毒癥患者T 淋巴細胞動態(tài)變化（±s）

注：①與嚴重膿毒癥組比較，P ＜0.05；②與膿毒性休克組比較，P ＜0.05。

組別 n 入院時 6 h 1 d 3 d 7 d CD4+/% 膿毒癥組 63 41.01±3.95① 36.85±2.71① 23.14±3.11① 26.82±3.31① 30.34±3.65① 嚴重膿毒癥組 39 36.36±2.88①② 30.22±2.85①② 20.69±2.62①② 21.85±3.11①② 24.59±4.12①② 膿毒性休克組 24 31.35±2.71 27.74±2.11 17.23±1.65 18.33±2.15 20.33±3.01 CD8+/% 膿毒癥組 63 31.25±2.67① 28.96±3.41① 25.11±2.41① 26.72±3.41① 28.85±3.62① 嚴重膿毒癥組 39 32.88±3.14 30.01±2.72 22.61±2.65 25.23±3.36 27.17±3.32 膿毒性休克組 24 33.35±3.41 31.45±2.83 21.56±2.79 23.45±3.12 25.04±3.23 CD4+/CD8+ 膿毒癥組 63 1.31±0.19① 1.27±0.18① 0.92±0.16① 1.00±0.17① 1.05±0.18① 嚴重膿毒癥組 39 1.10±0.16①② 1.01±0.14①② 0.91±0.15①② 0.87±0.16①② 0.90±0.19①② 膿毒性休克組 24 0.94±0.11 0.88±0.10 0.80±0.10 0.78±0.15 0.81±0.17

2.6 外周血T 淋巴細胞亞群與炎癥因子的相關性

Pearson 相關性分析顯示，膿毒癥患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與ESR 的相關性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與血清PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 和HMGB-1 均呈線性相關（P＜0.05）。見表6。

表5 不同程度膿毒癥患者血清炎癥因子動態(tài)變化（±s）

表5 不同程度膿毒癥患者血清炎癥因子動態(tài)變化（±s）

組別 n 入院時 6 h 1 d 3 d 7 d ESR/（mm/h） 膿毒癥組 63 28.81±8.23 30.21±9.69 32.14±10.68 36.81±12.24 25.12±10.44 嚴重膿毒癥組 39 32.12±11.85 33.35±12.82 36.64±12.32 44.02±14.21① 33.69±16.55① 膿毒性休克組 24 34.09±13.95 35.14±13.94 39.01±15.83① 50.32±16.94①② 46.24±18.47①②

續(xù)表5

表6 外周血T 淋巴細胞亞群與炎癥因子的相關性

3 討論

膿毒癥患者的免疫失調機制尚未完全闡明，主要認為炎癥細胞因子的系統(tǒng)性釋放誘發(fā)SIRS 的發(fā)生，而炎癥因子風暴被認為是膿毒癥發(fā)生發(fā)展及預后不良的關鍵機制[6]。TNF-α 是一種由活化巨噬細胞等分泌的小分子蛋白，過度表達時可激活炎癥級聯(lián)反應，促進IL-6 等炎癥介質的合成與釋放，導致炎癥反應失控。動物研究表明，膿毒癥大鼠呈現明顯的TNF-α 過度表達，且以膿毒性休克大鼠水平最高，在受到攻擊后1 h 即有明顯升高并持續(xù)至24 h[7]。IL-6是一種二級炎癥反應介質，對炎癥細胞及血管內皮細胞具有直接激活和毒性作用，且可誘導各類急性時相蛋白的生成，促進和放大炎癥反應，已有研究證實其與SIRS 嚴重程度及其致死率密切相關[8]。因IL-6 在循環(huán)中代謝清除速度較為緩慢容易檢測，故被視為膿毒癥病情嚴重程度的重要指標。ESR、PCT 和CRP 是臨床監(jiān)測急性感染的常用指標，其中ESR 的敏感性較高但特異性較低，不適用于疾病診斷，而PCT 及CRP被證實與膿毒癥的病情及預后密切相關。CRP 在感染4～6 h 即可急劇升高，2 d 左右即可達峰值，且隨著病情好轉可迅速降低；PCT 作為一種刺激炎癥因子，其本身無法啟動膿毒癥的發(fā)生，但可在IL-6、TNF-α等誘導下大量生成，可擴大和加重膿毒癥的病理生理進程，也是感染的早期敏感標志物之一[9]。HMGB-1是新近發(fā)現的晚期炎癥細胞因子，在受到炎癥等攻擊后約9～16 h 分泌，約24 h 后達峰值，其生成晚于IL-6、TNF-α 等早期炎癥因子但持續(xù)時間較長，可由IL-1β 或TNF-α 等刺激單核/巨噬細胞分泌，也可由壞死細胞釋放并轉移至細胞外。HMGB-1 高表達又可導致巨噬細胞進一步活化，促進IL-6、TNF-α等細胞因子的釋放[10]。部分研究證實，HMGB-1 過度表達與病死率密切相關，如楊婉等[11]研究顯示，入院時HMGB-1 高水平膿毒癥休克（＞35 pg/ml）患者在7 d 后APACHE Ⅱ評分低于低水平者（≤35 pg/ml），且3 個月內存活率明顯降低（44.4% VS 80.00%）。提示HMGB-1 高表達將增加膿毒癥的病情嚴重程度及治療難度，影響臨床預后。本研究結果顯示，膿毒癥患者入院時血清ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α 及HMGB-1 水平均高于對照組，且嚴重膿毒癥、膿毒性休克者的血清IL-6、TNF-α 進一步升高，提示膿毒癥患者的病情越重，其促炎細胞因子水平越高。動態(tài)觀察各組的血清炎癥細胞因子水平變化顯示，IL-6 及TNF-α 水平的峰值出現在入院后6 h，此后逐步下降，與溫前寬等[12]報道基本一致。HMGB-1 則在入院24 h 后達峰值并持續(xù)72 h，此后有所下降但仍維持較高水平。可見與其他早期炎癥因子比較，膿毒癥患者的HMGB-1 變化相對較晚但持續(xù)時間更長，可能與膿毒癥的晚期炎癥損傷有關。上述研究結果可見，持續(xù)性、壓倒性SIRS 可能是導致病情進展或最終發(fā)展為膿毒性休克的主要原因。但研究結果亦顯示，經過治療7 d 后，血ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α、HMGB-1 水平仍高于對照組，推測SIRS 并非膿毒癥的唯一原因，故引出CARS 的概念。

既往觀點認為，抗炎因子的升高是有利于防控炎癥反應的損傷，但近年來研究顯示，過度抗炎作用也將誘發(fā)免疫失衡，抗炎反應與促炎反應通常相伴發(fā)生。動物研究顯示，膿毒癥死亡動物模型的抗炎因子IL-10 峰值出現時間較促炎因子TNF-α 更早[13]；還有臨床研究顯示，隨訪28 d 內死亡膿毒癥患者的早期血清IL-10 水平升高且高于膿毒癥患者，且隨著病情進展IL-10 有持續(xù)升高趨勢[14]。由此可見，膿毒癥患者的早期免疫抑制狀態(tài)可能較SIRS 發(fā)生更早，且在膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程中抗炎反應持續(xù)存在。岳茂興等[15]研究則顯示，創(chuàng)傷性膿毒癥患者的血清IL-6、IL-10 及TNF-α 等細胞因子水平均在確診后第1 天即有明顯升高，且在第3 天達峰值，這與本研究結果略有差異，可能與患者入院前病程長短及病情嚴重程度不一有關?？傮w而言，認為在膿毒癥發(fā)病初期即有大量促炎細胞因子如IL-6、TNF-α 等釋放而誘發(fā)SIRS，同時伴有抗炎細胞因子如IL-10 等生成引起CARS，兩者之間呈現動態(tài)變化。在入院治療7 d 后，各組的ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 及HMGB-1 水平雖有不同程度的下降，但仍未恢復正常，尤其是膿毒性休克組的各指標水平仍處于較高水平，認為炎癥反應并非影響患者病情變化的唯一因素。

臨床研究顯示，相比于早期炎癥反應而言，超過80%的膿毒癥患者死于免疫抑制狀態(tài)下的感染，故免疫抑制可能是導致患者預后不良的關鍵因素[16]。關于炎癥細胞因子尤其是IL-10 等抗炎細胞因子對膿毒癥患者免疫功能及臨床預后的影響目前尚無定論，大部分研究認為IL-10 能夠抑制IL-6、TNF-α 促炎細胞因子的過度表達。新近研究發(fā)現，過度促炎反應可導致機體免疫損傷加重；同時，過度抗炎反應也可引起免疫功能紊亂，削弱機體對致病菌的殺傷或清除能力，重則誘發(fā)免疫麻痹狀態(tài)，增加繼發(fā)性感染風險[17]。T淋巴細胞是機體是影響免疫應答的關鍵細胞，T 淋巴細胞功能及數量紊亂在膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程中具有核心作用，其中CD4+T 淋巴細胞主要發(fā)揮協(xié)助體液和細胞免疫的作用，CD8+T 淋巴細胞則主要發(fā)揮抑制和殺傷作用，可誘導和維持免疫耐受。因此，CD4+/CD8+比值能夠較好地預估機體免疫狀態(tài)，CD4+細胞無反應或反應性降低均可導致其對CD8+細胞的輔助能力減弱，進而導致細胞的殺傷、溶解功能降低，即免疫應答的負調節(jié)占據相對優(yōu)勢[18]。本研究結果顯示，膿毒癥患者在入院初期即存在明顯的T 淋巴細胞亞群失衡，抑制性T 細胞比例升高而輔助性T 細胞比例下降，表現為CD4+/CD8+比值明顯降低，提示膿毒癥患者在早期即存在明顯的機體免疫抑制。進一步監(jiān)測不同時間點T 淋巴細胞亞群變化顯示，各組CD4+、CD8+在入院第1 天時達到谷值，此后逐步升高，但CD4+/CD8+在入院第3 天時仍持續(xù)下降，第7 天時方有所回升，且仍處于較低水平，尤其是膿毒性休克組的CD4+、CD4+/CD8+低于正常范圍。由此可見，膿毒癥發(fā)展后期仍具有明顯的免疫抑制，這可能也是影響臨床預后的重要因素。進一步Pearson 相關性分析顯示，觀察組患者的CD4+、CD4+/CD8+與血清PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 和HMGB-1 均呈負相關，與CD8+呈正相關，與文獻報道[19-20]基本相符。表明膿毒癥患者存在明顯的免疫-炎癥調節(jié)功能紊亂，且兩者之間相互影響而導致病情加重。但本研究未見T 淋巴細胞亞群與ESR 的明顯相關性，可能與ESR 在膿毒癥瀑布中的效應不明確有關。

綜上所述，膿毒癥患者存在明顯的免疫功能紊亂及促炎/抗炎細胞因子失衡，且兩者間相互作用進一步影響患者的病情，加強對T 淋巴細胞亞群及炎癥細胞因子的動態(tài)監(jiān)測對膿毒癥的臨床診療及預后評估具有一定的指導意義。但不同炎癥介質的變化時間特性存在一定的差異，且其在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制仍需進一步研究。