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        PKA干預淫羊藿苷治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎對中樞神經(jīng)CREB表達的影響*

        2019-09-17 01:19:58危智盛張鳳吳建良黃葉青刁勝朋洪銘范
        中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2019年17期
        關(guān)鍵詞:脊髓染色通路

        危智盛,張鳳,吳建良,黃葉青,刁勝朋,洪銘范

        (廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510080)

        多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎癥性脫髓鞘為主要病理變化的自身免疫性疾病。目前,針對該病仍缺乏有效的治療方法,對于急性或復發(fā)加重的治療,較公認的觀點仍是以大劑量糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)沖擊治療為主[1]。然而,大劑量GC 可導致某些嚴重的副作用,如消化道出血、高血糖、骨質(zhì)疏松等。因此,研究人員嘗試開發(fā)某些新的具有治療潛力的分子或藥物,以求減少GC 使用劑量甚至替代GC。

        本研究前期初步發(fā)現(xiàn),具有植物雌激素活性的中藥單體淫羊藿苷(Icariin,ICA)對MS 的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)有治療作用。ICA 主要通過雌激素受體β發(fā)揮雌激素效應,從而改善EAE病情[2]。ICA 還可通過調(diào)節(jié)HPA 軸、抗細胞凋亡等途徑與甲潑尼龍達到協(xié)同治療EAE 的作用[3],表明ICA 具有減少GC使用劑量的潛力,并具有良好的治療MS的前景。然而,ICA 的具體作用機制仍不十分清楚。為此本文在前期研究的基礎(chǔ)上,以信號通路的終止與交匯點環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)作為切入點,進一步深入探討ICA 的作用機制,以期明確并驗證ICA 對這一關(guān)鍵靶點的作用及機制,為開發(fā)新的治療MS 藥物提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物與試劑

        C57BL/6 小鼠,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,雌性,6~8 周齡,體重15~20 g,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(許可證號:SCXK 粵2013-0002)。MOG35-55(2568)購自美國Tocris Bioscience 公司,ICA(I1286)及H89(B1427)購自美國Sigma-Aldrich公司,BCA 蛋白濃度定量分析試劑盒(NCI3225CH)購自美國Thermo 公司,GAPDH 小鼠一抗(AF0006)、辣根酶標記羊抗小鼠IgG(A0216)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,CREB 兔一抗(9197S)購自美國CST 公司,辣根酶標記羊抗兔IgG(ab6721)購自英國Abcam 公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 EAE 模型復制及評估 采用C57BL/6 小鼠復制EAE 模型。用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將MOG35-55稀釋成300 μg/ml,然后將稀釋液與等量的完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)(結(jié)核桿菌的終濃度為4 mg/ml)混合,用玻璃注射器抽打至油包水狀態(tài),制備成誘導EAE的抗原乳劑。乳化后皮下注射于小鼠雙側(cè)側(cè)腹壁(分4 點,每個部位50 μl),免疫后7 d 加強免疫1 次(等劑量MOG/CFA)。在免疫后第0 及48 小時腹腔內(nèi)注射500 ng 百日咳毒素。免疫接種后每日觀察小鼠反應、進食、體重、行動等情況,并依據(jù)Becher 的標準[4]對神經(jīng)損害表現(xiàn)進行評分。0 分:正常或無任何神經(jīng)缺損癥狀;0.5 分:尾巴遠端無力;1 分:尾巴完全無力;1.5 分: 尾巴無力并后肢無力;2 分:單側(cè)后肢部分癱瘓;2.5 分: 雙側(cè)后肢部分癱瘓;3 分:雙側(cè)后肢完全癱瘓;3.5 分:雙后肢完全癱瘓并一側(cè)前肢癱瘓;4 分:四肢癱瘓;5 分:瀕臨死亡狀態(tài)或死亡。評分≥1 為臨床發(fā)病。

        1.2.2 病理學檢查 EAE 發(fā)病后,隨機取3 只小鼠進行蘇木精-伊紅(HE)染色,且髓鞘染色驗證模型是否符合病理標準。小鼠以4%多聚甲醛心臟灌注后,取脊髓頸膨大組織進行冷凍切片,再行HE 染色及勞克堅牢藍(luxol fast blue,LFB)髓鞘染色,光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

        1.2.3 實驗分組及給藥 EAE 發(fā)病小鼠按評分相當原則隨機取18 只入組,分成3組,每組6 只。模型對照組:予生理鹽水3 ml/d 灌胃;ICA組:予ICA 300 mg/(kg·d)灌胃;ICA+H89組:予ICA 300 mg/(kg·d)灌胃并予蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)特異性阻斷劑H89 5 mg/(kg·d)腹腔注射;另取6 只未經(jīng)模型復制的C57BL/6 小鼠同等條件下飼養(yǎng)作為正常對照組,予生理鹽水3 ml/d 灌胃。小鼠發(fā)病后,約3~5d 發(fā)病達高峰時開始給藥,1 次/d,連續(xù)給藥5d。每日進行神經(jīng)損害評分,至給藥結(jié)束后次日。給藥結(jié)束后次日進行神經(jīng)損害評分后處死小鼠,立即采集脊髓頸膨大部分進行Western blotting 檢測。

        1.2.4 Western blotting 檢測脊髓中CREB的表達分離小鼠脊髓頸膨大,將所取組織加入RIPA 裂解緩沖液制備成勻漿,置入-80℃冷凍保存。采用BCA 蛋白濃度定量分析試劑盒檢測總蛋白濃度。配平后行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜封閉液內(nèi)封閉1 h,加入CREB 及GAPDH 一抗,4℃過夜。次日TBST 緩沖液洗膜后,再加入辣根過氧化物酶標記二抗,室溫孵育1 h,TBST 緩沖液洗膜,然后以ECL 進行顯影曝光成像。將顯影后的膠片掃描至計算機內(nèi),采用Qantity One 凝膠圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶灰度進行分析,以CREB/GAPDH 灰度值分別表示CREB 的表達水平。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。首先對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,治療前后小鼠神經(jīng)損害評分采用Wilcoxon 秩和檢驗,多組間CREB/GAPDH 灰度值比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 EAE 小鼠發(fā)病情況

        免疫誘導后,小鼠于第13 和14 天先后發(fā)病,表現(xiàn)為體重進行性下降、尾巴張力減退,繼之尾巴無力,并發(fā)展為后肢或四肢無力、麻痹、大小便失禁,約3~5d 發(fā)病達高峰。EAE 小鼠脊髓組織HE 染色,光學顯微鏡下可見小血管充血,管壁增厚,內(nèi)皮細胞有破壞,血管周圍大量炎癥細胞浸潤,以淋巴細胞為主,并在小血管周圍形成典型的袖套樣改變(見圖1A)。LFB 髓鞘染色,光學顯微鏡下可見髓鞘呈藍色,EAE小鼠脊髓組織可見髓鞘有不同程度脫失(見圖1B)。

        2.2 EAE 小鼠治療前后神經(jīng)損害評分的比較

        ICA組小鼠神經(jīng)損害表現(xiàn)有明顯改善,與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而ICA+H89組小鼠及模型對照組小鼠,神經(jīng)損害評分均無改善,治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1和圖2。

        2.3 ICA 治療對CREB 表達的影響

        Western blotting灰度值結(jié)果示,模型對照組(1.000± 0.151),正常對照組(1.703±0.182),ICA組(2.204± 0.247),ICA+H89組(1.243±0.194)。4組比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=45.212,P=0.000)。模型對照組脊髓組織中CREB 的表達較正常對照組降低(P<0.05)。治療后ICA組與模型對照組比較,CREB 的表達升高(P<0.05)。但ICA+H89組小鼠脊髓組織中CREB 的表達與模型對照組比較,并未升高(P>0.05)。見圖3。

        圖1 EAE 模型組小鼠脊髓頸膨大染色結(jié)果(×100)

        表1 EAE 小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分比較(n =6,±s)

        表1 EAE 小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分比較(n =6,±s)

        組別 給藥前1 天(治療前)給藥第6 天(治療后) Z 值 P 值模型對照組 1.832±0.407 1.752±0.419 -1.577 0.115 ICA組 2.083±0.576 1.423±0.583 -2.201 0.028 ICA+H89組 1.932±0.417 1.903±0.556 -0.105 0.917

        圖2 各組小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分的變化趨勢(n =6,±s)

        圖3 ICA 治療對CREB 表達的影響

        3 討論

        淫羊藿是一種富含植物雌激素的補腎中藥,是MS 中醫(yī)辨證治療中常用的中藥之一。而ICA 作為淫羊霍的活性單體,是其發(fā)揮雌激素活性的主要物質(zhì)。近年來,ICA 的藥理作用已成為多學科領(lǐng)域所關(guān)注的熱點。有研究發(fā)現(xiàn),ICA 具有神經(jīng)保護作用、改善心腦血管系統(tǒng)功能、抗炎、增強免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[5-6]。本研究前期也發(fā)現(xiàn)ICA 對EAE 有治療作用,然而,ICA 對EAE 治療的具體機制尚不明確,ICA 是如何介導EAE 的神經(jīng)保護、參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用,亟待進一步研究解答。

        近年來,核轉(zhuǎn)錄因子CREB 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的發(fā)揮的作用越來越被關(guān)注。研究表明,其在參與神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等方面發(fā)揮著重要作用[7-8]。CREB 是一種真核生物細胞核內(nèi)調(diào)控因子,在神經(jīng)系統(tǒng)中通常作為許多信號通路的終止與交匯點,包括G蛋白偶聯(lián)受體激活的cAMP/PKA 通路、電壓敏感型鈣離子通道(voltage-sensitive calcium channel,VSCC)或激活鈣離子/鈣離子結(jié)合蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase,CaMK)通路、生長因子/受體酪氨酸激酶(Ras/Erk/RSK2)通路、應激或炎癥相關(guān)的細胞因子通路,如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、PI3K/AKT 等[9]。胞內(nèi)外信號分子可通過不同的通路作用于CREB,從而激活相關(guān)信號分子及其靶基因的轉(zhuǎn)錄。其調(diào)控的上下游信號分子及其靶基因和CREB 一起參與神經(jīng)干細胞增殖、細胞周期調(diào)控、神經(jīng)元誘導分化、學習記憶等正常生理活動。CREB 可以介導神經(jīng)元對各種神經(jīng)營養(yǎng)因子包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等的反應,從而調(diào)控神經(jīng)再生、細胞修復及突觸可塑性等功能[10-11]。因此,CREB 可能在MS 或EAE 的神經(jīng)保護、修復等環(huán)節(jié)上發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

        本研究通過動物體內(nèi)實驗,驗證ICA 具有提高EAE 小鼠脊髓組織中CREB 表達的作用,且CREB表達的升高與EAE 小鼠神經(jīng)損害評分的改善密切相關(guān),提示CREB 參與ICA 對EAE 的治療過程,而這一治療作用可被PKA 特異性阻斷劑H89 所阻斷,表明ICA 可能是通過PKA 途徑增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CREB的表達,從而發(fā)揮對EAE 的治療作用。近年來,也有類似的研究發(fā)現(xiàn),ICA 可通過活化cAMP/ PKA/CREB途徑促進骨細胞的生成[12],表明ICA 對PKA/CREB 這一信號通路的調(diào)控,是其發(fā)揮神經(jīng)保護、細胞增殖等治療作用的重要機制之一。本研究初步闡明ICA 對信號通路的終止與交匯點CREB,這一關(guān)鍵靶點的作用,今后還有待進一步從分子層面、體外實驗等角度驗證CREB 在ICA 治療過程中的客觀必要性,為揭示ICA 的作用機制,探索開發(fā)新的治療MS 藥物提供實驗依據(jù)。

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