危智盛，張鳳，吳建良，黃葉青，刁勝朋，洪銘范

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510080）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎癥性脫髓鞘為主要病理變化的自身免疫性疾病。目前，針對該病仍缺乏有效的治療方法，對于急性或復(fù)發(fā)加重的治療，較公認(rèn)的觀點(diǎn)仍是以大劑量糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid,GC）沖擊治療為主[1]。然而，大劑量GC 可導(dǎo)致某些嚴(yán)重的副作用，如消化道出血、高血糖、骨質(zhì)疏松等。因此，研究人員嘗試開發(fā)某些新的具有治療潛力的分子或藥物，以求減少GC 使用劑量甚至替代GC。

本研究前期初步發(fā)現(xiàn)，具有植物雌激素活性的中藥單體淫羊藿苷（Icariin,ICA）對MS 的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）有治療作用。ICA 主要通過雌激素受體β發(fā)揮雌激素效應(yīng)，從而改善EAE病情[2]。ICA 還可通過調(diào)節(jié)HPA 軸、抗細(xì)胞凋亡等途徑與甲潑尼龍達(dá)到協(xié)同治療EAE 的作用[3]，表明ICA 具有減少GC使用劑量的潛力，并具有良好的治療MS的前景。然而，ICA 的具體作用機(jī)制仍不十分清楚。為此本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以信號通路的終止與交匯點(diǎn)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）作為切入點(diǎn)，進(jìn)一步深入探討ICA 的作用機(jī)制，以期明確并驗(yàn)證ICA 對這一關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用及機(jī)制，為開發(fā)新的治療MS 藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

C57BL/6 小鼠，無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級，雌性，6～8 周齡，體重15～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號：SCXK 粵2013-0002）。MOG35-55（2568）購自美國Tocris Bioscience 公司，ICA（I1286）及H89（B1427）購自美國Sigma-Aldrich公司，BCA 蛋白濃度定量分析試劑盒（NCI3225CH）購自美國Thermo 公司，GAPDH 小鼠一抗（AF0006）、辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（A0216）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CREB 兔一抗（9197S）購自美國CST 公司，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（ab6721）購自英國Abcam 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EAE 模型復(fù)制及評估 采用C57BL/6 小鼠復(fù)制EAE 模型。用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）將MOG35-55稀釋成300 μg/ml，然后將稀釋液與等量的完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant,CFA）（結(jié)核桿菌的終濃度為4 mg/ml）混合，用玻璃注射器抽打至油包水狀態(tài)，制備成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。乳化后皮下注射于小鼠雙側(cè)側(cè)腹壁（分4 點(diǎn)，每個(gè)部位50 μl），免疫后7 d 加強(qiáng)免疫1 次（等劑量MOG/CFA）。在免疫后第0 及48 小時(shí)腹腔內(nèi)注射500 ng 百日咳毒素。免疫接種后每日觀察小鼠反應(yīng)、進(jìn)食、體重、行動(dòng)等情況，并依據(jù)Becher 的標(biāo)準(zhǔn)[4]對神經(jīng)損害表現(xiàn)進(jìn)行評分。0 分：正?；驘o任何神經(jīng)缺損癥狀；0.5 分：尾巴遠(yuǎn)端無力；1 分：尾巴完全無力；1.5 分： 尾巴無力并后肢無力；2 分：單側(cè)后肢部分癱瘓；2.5 分： 雙側(cè)后肢部分癱瘓；3 分：雙側(cè)后肢完全癱瘓；3.5 分：雙后肢完全癱瘓并一側(cè)前肢癱瘓；4 分：四肢癱瘓；5 分：瀕臨死亡狀態(tài)或死亡。評分≥1 為臨床發(fā)病。

1.2.2 病理學(xué)檢查 EAE 發(fā)病后，隨機(jī)取3 只小鼠進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，且髓鞘染色驗(yàn)證模型是否符合病理標(biāo)準(zhǔn)。小鼠以4%多聚甲醛心臟灌注后，取脊髓頸膨大組織進(jìn)行冷凍切片，再行HE 染色及勞克堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue,LFB）髓鞘染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 EAE 發(fā)病小鼠按評分相當(dāng)原則隨機(jī)取18 只入組，分成3組，每組6 只。模型對照組：予生理鹽水3 ml/d 灌胃；ICA組：予ICA 300 mg/（kg·d）灌胃；ICA+H89組：予ICA 300 mg/（kg·d）灌胃并予蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）特異性阻斷劑H89 5 mg/（kg·d）腹腔注射；另取6 只未經(jīng)模型復(fù)制的C57BL/6 小鼠同等條件下飼養(yǎng)作為正常對照組，予生理鹽水3 ml/d 灌胃。小鼠發(fā)病后，約3～5d 發(fā)病達(dá)高峰時(shí)開始給藥，1 次/d，連續(xù)給藥5d。每日進(jìn)行神經(jīng)損害評分，至給藥結(jié)束后次日。給藥結(jié)束后次日進(jìn)行神經(jīng)損害評分后處死小鼠，立即采集脊髓頸膨大部分進(jìn)行Western blotting 檢測。

1.2.4 Western blotting 檢測脊髓中CREB的表達(dá)分離小鼠脊髓頸膨大，將所取組織加入RIPA 裂解緩沖液制備成勻漿，置入-80℃冷凍保存。采用BCA 蛋白濃度定量分析試劑盒檢測總蛋白濃度。配平后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜封閉液內(nèi)封閉1 h，加入CREB 及GAPDH 一抗，4℃過夜。次日TBST 緩沖液洗膜后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜，然后以ECL 進(jìn)行顯影曝光成像。將顯影后的膠片掃描至計(jì)算機(jī)內(nèi)，采用Qantity One 凝膠圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶灰度進(jìn)行分析，以CREB/GAPDH 灰度值分別表示CREB 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。首先對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，治療前后小鼠神經(jīng)損害評分采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，多組間CREB/GAPDH 灰度值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE 小鼠發(fā)病情況

免疫誘導(dǎo)后，小鼠于第13 和14 天先后發(fā)病，表現(xiàn)為體重進(jìn)行性下降、尾巴張力減退，繼之尾巴無力，并發(fā)展為后肢或四肢無力、麻痹、大小便失禁，約3～5d 發(fā)病達(dá)高峰。EAE 小鼠脊髓組織HE 染色，光學(xué)顯微鏡下可見小血管充血，管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞有破壞，血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，并在小血管周圍形成典型的袖套樣改變（見圖1A）。LFB 髓鞘染色，光學(xué)顯微鏡下可見髓鞘呈藍(lán)色，EAE小鼠脊髓組織可見髓鞘有不同程度脫失（見圖1B）。

2.2 EAE 小鼠治療前后神經(jīng)損害評分的比較

ICA組小鼠神經(jīng)損害表現(xiàn)有明顯改善，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ICA+H89組小鼠及模型對照組小鼠，神經(jīng)損害評分均無改善，治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和圖2。

2.3 ICA 治療對CREB 表達(dá)的影響

Western blotting灰度值結(jié)果示，模型對照組（1.000± 0.151），正常對照組（1.703±0.182），ICA組（2.204± 0.247），ICA+H89組（1.243±0.194）。4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.212，P=0.000）。模型對照組脊髓組織中CREB 的表達(dá)較正常對照組降低（P＜0.05）。治療后ICA組與模型對照組比較，CREB 的表達(dá)升高（P＜0.05）。但I(xiàn)CA+H89組小鼠脊髓組織中CREB 的表達(dá)與模型對照組比較，并未升高（P＞0.05）。見圖3。

圖1 EAE 模型組小鼠脊髓頸膨大染色結(jié)果（×100）

表1 EAE 小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分比較（n =6，±s）

表1 EAE 小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分比較（n =6，±s）

組別 給藥前1 天（治療前）給藥第6 天（治療后） Z 值 P 值模型對照組 1.832±0.407 1.752±0.419 -1.577 0.115 ICA組 2.083±0.576 1.423±0.583 -2.201 0.028 ICA+H89組 1.932±0.417 1.903±0.556 -0.105 0.917

圖2 各組小鼠給藥前后神經(jīng)損害評分的變化趨勢（n =6，±s）

圖3 ICA 治療對CREB 表達(dá)的影響

3 討論

淫羊藿是一種富含植物雌激素的補(bǔ)腎中藥，是MS 中醫(yī)辨證治療中常用的中藥之一。而ICA 作為淫羊霍的活性單體，是其發(fā)揮雌激素活性的主要物質(zhì)。近年來，ICA 的藥理作用已成為多學(xué)科領(lǐng)域所關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ICA 具有神經(jīng)保護(hù)作用、改善心腦血管系統(tǒng)功能、抗炎、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[5-6]。本研究前期也發(fā)現(xiàn)ICA 對EAE 有治療作用，然而，ICA 對EAE 治療的具體機(jī)制尚不明確，ICA 是如何介導(dǎo)EAE 的神經(jīng)保護(hù)、參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用，亟待進(jìn)一步研究解答。

近年來，核轉(zhuǎn)錄因子CREB 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的發(fā)揮的作用越來越被關(guān)注。研究表明，其在參與神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等方面發(fā)揮著重要作用[7-8]。CREB 是一種真核生物細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控因子，在神經(jīng)系統(tǒng)中通常作為許多信號通路的終止與交匯點(diǎn)，包括G蛋白偶聯(lián)受體激活的cAMP/PKA 通路、電壓敏感型鈣離子通道（voltage-sensitive calcium channel,VSCC）或激活鈣離子/鈣離子結(jié)合蛋白依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinase,CaMK）通路、生長因子/受體酪氨酸激酶（Ras/Erk/RSK2）通路、應(yīng)激或炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、PI3K/AKT 等[9]。胞內(nèi)外信號分子可通過不同的通路作用于CREB，從而激活相關(guān)信號分子及其靶基因的轉(zhuǎn)錄。其調(diào)控的上下游信號分子及其靶基因和CREB 一起參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、神經(jīng)元誘導(dǎo)分化、學(xué)習(xí)記憶等正常生理活動(dòng)。CREB 可以介導(dǎo)神經(jīng)元對各種神經(jīng)營養(yǎng)因子包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等的反應(yīng)，從而調(diào)控神經(jīng)再生、細(xì)胞修復(fù)及突觸可塑性等功能[10-11]。因此，CREB 可能在MS 或EAE 的神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)等環(huán)節(jié)上發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

本研究通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證ICA 具有提高EAE 小鼠脊髓組織中CREB 表達(dá)的作用，且CREB表達(dá)的升高與EAE 小鼠神經(jīng)損害評分的改善密切相關(guān)，提示CREB 參與ICA 對EAE 的治療過程，而這一治療作用可被PKA 特異性阻斷劑H89 所阻斷，表明ICA 可能是通過PKA 途徑增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CREB的表達(dá)，從而發(fā)揮對EAE 的治療作用。近年來，也有類似的研究發(fā)現(xiàn)，ICA 可通過活化cAMP/ PKA/CREB途徑促進(jìn)骨細(xì)胞的生成[12]，表明ICA 對PKA/CREB 這一信號通路的調(diào)控，是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞增殖等治療作用的重要機(jī)制之一。本研究初步闡明ICA 對信號通路的終止與交匯點(diǎn)CREB，這一關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用，今后還有待進(jìn)一步從分子層面、體外實(shí)驗(yàn)等角度驗(yàn)證CREB 在ICA 治療過程中的客觀必要性，為揭示ICA 的作用機(jī)制，探索開發(fā)新的治療MS 藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。