黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000

毛茛為毛茛科植物RanuncuLusjaponicusT.的全草，含黃酮類、內(nèi)酯類、皂苷類及生物堿等活性成分，具有利濕、消腫、退翳、截瘧、殺蟲的功效，臨床主要用于治療瘧疾、黃疸、偏頭痛、胃痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、鶴膝風(fēng)等疾病[1]。在貴州水族聚集地區(qū)亦被廣泛用于治療牙痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛及瘧疾，水藥譯名罵搞[2]，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。其所含總皂苷具有抗心肌肥大、降血壓、抗腫瘤、抗心肌缺血、擴(kuò)張血管等廣泛生物活性[3-10]，齊墩果酸型三萜皂苷是產(chǎn)生上述生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)擬以黔產(chǎn)毛茛為樣本，總皂苷含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選毛茛總皂苷的提取方法和工藝，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用黔產(chǎn)毛茛和建立毛茛的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 試藥 毛茛采于貴州省都勻市大坪鎮(zhèn)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥教研室李香副教授鑒定為毛茛科植物毛茛RanuncuLusjaponicusT.的全草。齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：151015，成都克洛瑪生物科技有限公司)。余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Cary 100型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京安捷倫公司)；SG-4050C型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；G80F20CN-B8型微波爐(格蘭仕集團(tuán))；AE240型電子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 型超聲波清洗機(jī)(杭州匯爾公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備 取干燥至恒重過三號(hào)篩的毛茛粉末約3 g，置125 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇20 mL，回流3 h，過濾，用容量瓶定容至50 mL，搖勻。精密量取20 mL置蒸發(fā)皿中揮散溶劑，殘?jiān)?0 mL蒸餾水溶解，用水飽和正丁醇萃取三次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干。殘?jiān)由倭考状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取1 mL溶液至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，備用[11]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品6.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配置得的對(duì)照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分別加入7支干燥具塞磨口試管中，水浴揮干溶劑，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，高氯酸1.6 mL，于70 ℃恒溫水浴加熱20 min，取出，流水冷卻3 min，加入冰醋酸5 mL，搖勻，隨行試劑空白，于542 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2.527 2X-0.081 1，r=0.9993。對(duì)照品溶液在0.024～0.168 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.5 mL至干燥具塞磨口試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果RSD值為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品溶液2.5 mL至干燥具塞磨口試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，并在顯色后1、2、3、4、5、6、7 h測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD值為0.79%，表明樣品溶液顯色后在7 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取干燥至恒重過三號(hào)篩的同一毛茛粉末3 g，6份，按“2.1”項(xiàng)下制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液2.5 mL至干燥具塞磨口試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算總皂苷含量，結(jié)果RSD值為1.10%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) (n=6)

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一毛茛粉末約1.5 g，6份，每份樣品中分別加入適量齊墩果酸對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率平均值為98.20%，RSD值為1.49%，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定 精密吸取樣品溶液2.5 mL各5份至干燥具塞磨口試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，于542 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得藥材中總皂苷含量為(44.88±0.71)mg/g(n=5)。

2.9 提取方法考察 稱取9份過三號(hào)篩干燥至恒重的毛茛粉末各約3 g，選取水、甲醇、95%乙醇為提取溶媒，溶劑用量30倍，分別采用超聲、回流、微波法提取30 min，按“2.1”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度，結(jié)果見表3。

表3 不同溶媒和提取方法總皂苷的含量 (mg/g，n=3)

結(jié)果顯示：同一提取方法，95%乙醇為溶媒與水、甲醇為溶媒對(duì)總皂苷的提取率影響具有差異(P<0.05)，以95%乙醇為溶媒提取率高；以95%乙醇為溶媒，回流法提取與超聲法提取、微波法提取對(duì)總皂苷提取率影響具顯著性差異(P<0.01)，以回流提取法高。確定毛茛總皂苷以95%乙醇為溶媒，回流法提取為佳。

2.10 提取工藝優(yōu)選 結(jié)合單因素分析預(yù)試驗(yàn)考察結(jié)果，設(shè)定提取次數(shù)為2次、提取溫度為80℃，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，各因素取3水平。稱取9份黔產(chǎn)毛茛樣品，L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表4，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表5，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，方差分析見表6，以直觀分析和方差分析判斷各因素對(duì)毛茛總皂苷提取率的影響，篩選最佳工藝。

表4 因素與水平

表5 正交實(shí)驗(yàn)安排表及結(jié)果

表6 方差分析

注：F0.01(2，2)=99.0，F(xiàn)0.05(2，2)=19.0。

由表5可知，影響毛茛總皂苷提取率的因素順序?yàn)锳>C>B，結(jié)合K值，可選擇提取工藝為A2B3C1。表6方差分析結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和提取時(shí)間(C)對(duì)提取率影響顯著(P<0.05)，液固比(B)影響不顯著，故確定提取的最優(yōu)工藝條件為：A2B1C1，即回流法提取，以85%乙醇為溶媒，用量10倍，在提取溫度80℃條件下提取2次，每次2 h。

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取黔產(chǎn)毛茛樣品5份，按優(yōu)選的提取方法和工藝進(jìn)行提取，毛茛總皂苷提取率為54.49±0.23 mg/g，與優(yōu)選前“2.8”項(xiàng)下樣品含量測(cè)定的提取率具顯著性差異(P<0.01)；RSD=1.68%，表明優(yōu)選的提取方法和工藝是合理、可行的。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)對(duì)藥材提取液進(jìn)行了直接測(cè)定和比色法測(cè)定比較，結(jié)果顯示：直接測(cè)定齊墩果酸對(duì)照品在205 nm有最大吸收，但樣品在此處容易被其他物質(zhì)干擾；比色法測(cè)定對(duì)照品和樣品在542 nm均有最大吸收，且無其他物質(zhì)干擾，因此選擇比色法進(jìn)行測(cè)定。

試驗(yàn)利用皂苷類成分具有溶于水、甲醇、乙醇等極性較大溶劑的化學(xué)性質(zhì)，考察了上述3種溶劑分別采用回流、超聲、微波3種提取方法下總皂苷提取率的差異性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，確定提取方法。結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)毛茛總皂苷的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度的考察結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察該提取方法下總皂苷提取工藝，經(jīng)直觀分析和方差分析后，確定最優(yōu)提取工藝。該設(shè)計(jì)方案較為全面地考察了影響毛茛總皂苷提取的各種因素，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，避免了采用單一溶媒、單一提取方法評(píng)價(jià)總皂苷提取方法和工藝的局限性。