1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 湖南 湘潭 411102 ； 2.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515

陰地蕨為陰地蕨科植物陰地蕨Botrychiumternatum(Thunb.)Sw.的全草。廣泛分布于云南、貴州、湖北、湖南、廣西等地，《中華本草》[1]和《中藥大辭典》中均有收錄[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為陰地蕨味甘、苦，性微寒，具有清熱解毒，平肝熄風(fēng)，明目去翳之功效。臨床常用于小兒高熱驚搐，肺熱咳嗽，目赤翳障等癥的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，陰地蕨中的木犀草素具有多種藥理活性：抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)咳、抗纖維化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[3～5]。

隨著最近幾年國(guó)家的 “精準(zhǔn)扶貧”政策，廣大山區(qū)種植中藥材業(yè)已成為不少農(nóng)村脫貧致富的好途徑，陰地蕨作為云貴地區(qū)的民族藥，分布十分廣泛，具有較大的研究和開(kāi)發(fā)意義。但作為人工種植的陰地蕨藥材，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地開(kāi)發(fā)利用這一藥材資源，筆者對(duì)其中木犀草素含量的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律進(jìn)行了研究。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 UV-2201型紫外分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)，LC-20A T高效液相色譜儀(日本島津儀器公司，SPD-20A型紫外檢測(cè)器，CTO-10AS vp型柱溫箱，CBM-102型工作站)，SY25-1200型超聲波清洗器(張家港市三友超音設(shè)備有限公司)，0.45 μm微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(長(zhǎng)沙旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 藥材 研究所用陰地蕨樣品分別在國(guó)內(nèi)3個(gè)省區(qū)(云南省昆明市西山區(qū)，貴州省銅仁市萬(wàn)山區(qū)，湖南省益陽(yáng)市安化縣)收集，共24份，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定，所采集樣品均為陰地蕨科(Botrychiaceae)植物陰地蕨(Botrychium ternatum)的全株。2018年6月至2019年9月采收陰地蕨全株，洗凈，曬干。

1.3 試劑 木犀草素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)：111520-201605)，乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170615)、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170814)、異丙醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20170513)為色譜純，實(shí)驗(yàn)研究所用其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 取木犀草素對(duì)照品0. 50 mg，精密稱量，置于5 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 陰地蕨供試品溶液制備 取陰地蕨樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，將藥材粉末置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲(功率500W，頻率40kHz)處理45 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[6-7]。

2.3 色譜條件及適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為菲羅門(mén)ODS(150 mm×4.6 mm，4 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(45∶55)；流速1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。在此條件下，理論板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.4 測(cè)定法 分別精密吸取木犀草素對(duì)照品溶液與陰地蕨供試品溶液各20 μL，注入液相色譜，測(cè)定，即得，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

2.5 線性關(guān)系考察 分別從0.104 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取5、10、15、20、25 μL，作HPLC分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，木犀草素對(duì)照品含量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得木犀草素的線性方程為：Y=2175628X+2104，r=0.9998，表明木犀草素的進(jìn)樣量在0.251～2.004 μg范圍內(nèi)時(shí)線性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取木犀草素對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各次峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陰地蕨藥材藥材粉末1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h依次注入高效液相色譜儀，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)木犀草素的峰面積，并計(jì)算其RSD(%)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 對(duì)照品精密度試驗(yàn)

表2 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取陰地蕨藥材1 g，精密稱定，按照“2.2項(xiàng) 陰地蕨供試品溶液制備”的方法，平行制備樣品溶液6份，分別進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定樣品含量，并其計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品重復(fù)性試驗(yàn)

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的陰地蕨藥材樣品粉末6份，各約0.5 g，精密稱定。分別精密加入濃度為0.104 mg·mL-1的木犀草素對(duì)照品溶液1.5 mL，按 “2. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，按 “2. 3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位(根、莖、葉)的陰地蕨藥材適量，精密稱定，按供試品溶液制備(2.2)項(xiàng)下制備樣品溶液。取樣品溶液和木犀草素對(duì)照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算木犀草素的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 木犀草素的加樣回收率試驗(yàn)

表5 不同產(chǎn)地、不同采收期、不用部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量

3 結(jié)論

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知[8-9]：陰地蕨木犀草素易溶于甲醇，故在實(shí)驗(yàn)中選擇甲醇作為提取溶劑。在實(shí)驗(yàn)中先后考察了回流提取法與超聲提取法，通過(guò)HPLC分析對(duì)比，發(fā)現(xiàn)上述兩種提取方法所得的陰地蕨藥材中木犀草素含量相似。但超聲提取法更快捷、方便, 故選用超聲提取法對(duì)陰地蕨藥材樣品進(jìn)行處理。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中還對(duì)流動(dòng)相的比例(體積)進(jìn)行了充分的考察，選用甲醇-乙腈-水(20∶40∶40)、乙腈-水(42∶58)、甲醇-醋酸-水(60∶0.1∶39)等作流動(dòng)相，木犀草素的分離度和理論塔板數(shù)均達(dá)不到要求。經(jīng)過(guò)多次、反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(45∶55)為流動(dòng)相，木犀草素可以與相鄰成分達(dá)到基線分離，峰形較好，基線平穩(wěn)，符合要求[10-11]。

分別對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期、不同藥用部位陰地蕨中木犀草素的含量進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的陰地蕨藥材在同一采收期木犀草素的含量無(wú)明顯差異；不同部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量差別很大，即葉>莖>根；不同產(chǎn)地陰地蕨藥材中木犀草素的含量呈規(guī)律性變化，其中6月初到7月中旬木犀草素的含量呈上升趨勢(shì)，7月下旬到8月上中旬含量較高，隨后逐漸下降。故建議陰地蕨的根不作為入藥部位，以地上部分作為入藥部位，每年8月份為陰地蕨藥材的最佳采收期。