徐清，李夢，羅雪梅，孟杰親，張帆，陳秀芬，劉春生，楊瑤珺*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700

龜甲為龜科動(dòng)物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，具有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心、固精止汗的作用，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈?zāi)肯?、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、筋骨痿軟、心虛健忘、崩漏經(jīng)多等癥[1]。

龜甲及其混偽品藥材在活體動(dòng)物上的鑒別有很強(qiáng)的鑒別特性，易于區(qū)分，但在處理成龜甲藥材時(shí)或在處理成粉末時(shí)，帶有鑒別特征的龜甲條紋外層部分易脫落，增加了性狀鑒別的難度[2-4]。2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的龜甲鑒別方法為薄層色譜法，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]及前期實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)薄層色譜法對不同品種龜甲的鑒別有一定局限性，高效液相色譜法分析時(shí)間較長且操作較復(fù)雜，故筆者采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對龜甲及其混偽品的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行初步鑒別，從蛋白水平上對其進(jìn)行鑒別研究。

1 材料

1.1 樣品

樣品為來自表1中不同產(chǎn)地及批次的共53批龜甲及混偽品藥材，其中35批龜甲為正品龜甲，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定，均為龜科動(dòng)物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲。

1.2 儀器

電泳儀(型號AE-8135，ATTO公司)；電泳槽(型號Tetra System，Bio-Rad)；玻璃板(長板/短板，Bio-Rad)；灌膠架(型號1653304，Bio-Rad)；加樣梳[10孔(1 mm)(Bio-Rad)]；超聲清洗器(型號KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)；冷凍離心機(jī)(3K-15低溫高速離心機(jī)，SIGMA公司)；脫色搖床(型號TS-1，其林貝爾儀器銷售公司)；玻璃培養(yǎng)皿(型號100 mm，北京高華偉業(yè)食品添加劑有限公司)。

1.3 試劑

蒸餾水(規(guī)格4.5 L，廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；SDS(規(guī)格100 g，北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(規(guī)格500 g，北京化工廠)；鹽酸(規(guī)格100 mL，北京化工廠)；丙烯酰胺(規(guī)格100 g，北京化工廠)；甘氨酸(規(guī)格500 g，北京化工廠)；蔗糖(規(guī)格500 g，北京化工廠)；考馬斯亮藍(lán)G250(規(guī)格25 g，北京化工廠)；蛋白Marker(規(guī)格20次，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；四甲基乙二胺(規(guī)格50 mL，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；4×樣品緩沖液(規(guī)格5 mL，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；Ripa裂解液(規(guī)格50 mL，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(規(guī)格1 g，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。

表1 龜甲樣品信息

2 方法

2.1 樣品制備

取研磨后的正品龜甲細(xì)粉樣品，用液氮再次研細(xì)，精密稱取20 mg，加入4×蛋白質(zhì)Loading Buffer 100 μL，雙蒸水300 μL，將其稀釋成1×的緩沖液，100 ℃水浴10～20 min，冷卻后，用冷凍離心機(jī)14 000 r·min-1離心10 min，取上清液至1.5 mL離心管中，存放至4 ℃環(huán)境備用。

2.2 膠板制備

2.2.1 分離膠(12%)和濃縮膠(5%)的配制 按表2配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)(需要在最后向制膠器中倒入凝膠前再加)，加的時(shí)候要迅速，防止膠提前凝固。所需試劑及具體用量見表2。

表2 SDS-PAGE配制所需試劑 mL

注：—表示不添加試劑。

2.2.2 膠板的制備 用蒸餾水將玻璃板沖洗干凈并晾干。按照裝置的說明書組裝好制膠器，用水檢測是否漏水。吸取配好的12%離膠，注入兩玻璃板之間至約占整個(gè)板的四分之三的高度。待分離膠凝固好，倒凈兩塊玻璃板中剩余的液體，注滿5%的濃縮膠，插入梳子，放置2 h以上。待濃縮膠完全凝固后緩慢拔出梳子，用電泳緩沖液填滿點(diǎn)樣孔準(zhǔn)備點(diǎn)樣。

2.2.3 SDS-PAGE電泳 將離心得到的上清樣品與4× Protein Loading buffer按照3∶1的比例充分混勻。渦旋混勻后，沸水浴15～20 min使蛋白變性，沸水浴之后立即放置冰上冷卻2 min，再用14 000 r·min-1離心2 min。將離心之后的上清液進(jìn)行點(diǎn)樣(10 μL)，先用80 V的電壓使蛋白條帶跑過濃縮膠，再調(diào)整電壓至120 V，待蛋白條帶跑到玻璃板底部即可停止跑膠。

2.2.4 膠板的染色與脫色 將膠小心地從玻璃板中取出，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，振蕩過夜。倒出染色液，將膠放入脫色液中，多次振蕩脫色，直到蛋白條帶清晰，藍(lán)色背景脫掉為止。將凝膠拍照并保存。

3 結(jié)果

3.1 龜甲背甲及腹甲藥材的SDS-PAGE

通過對不同品種龜甲背甲與腹甲的SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于同一品種的龜甲，其背甲與腹甲的蛋白質(zhì)亞基相似，電泳得到的蛋白質(zhì)條帶幾乎無明顯差別，難以通過一維電泳方法對龜甲的背甲與腹甲進(jìn)行區(qū)分。在本實(shí)驗(yàn)中其蛋白質(zhì)亞基幾乎沒有區(qū)別，以至于蛋白條帶幾乎相同，同時(shí)也意味著在后續(xù)本實(shí)驗(yàn)中無需將龜甲背甲與腹甲分開進(jìn)行討論。

圖1 2a2b對比圖

圖2 3a3b對比圖

圖3 4a4b對比圖

圖4 5a5b對比圖

圖5 6a6b對比圖

圖6 13a13b對比圖

3.2 不同批次正品龜甲的SDS-PAGE

通過得到的電泳圖發(fā)現(xiàn)(見圖7～8)，該20批正品龜甲藥材分離得到的蛋白亞基幾乎相同，即正品龜甲在一維電泳中顯現(xiàn)出的蛋白亞基條帶差異性很小，其得到的蛋白條帶及蛋白分離情況不易受產(chǎn)地、批次等因素影響，同時(shí)也可看出龜甲的一維電泳實(shí)驗(yàn)有較強(qiáng)的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

圖7 1～10批正品龜甲電泳膠圖

圖8 11～20批正品龜甲電泳膠圖

3.3 正品及偽品龜甲藥材的SDS-PAGE

結(jié)果見圖9。

通過比較分析圖9，可以看出各品種龜甲的蛋白條帶各有差異，蛋白亞基的分子質(zhì)量均在10～200 kDa。在63～180 kDa，12個(gè)品種的龜甲蛋白質(zhì)條帶相似，無明顯區(qū)別；在15～63 kDa，各品種的龜甲蛋白質(zhì)條帶有明顯區(qū)別；在11～15 kDa以及11 kDa以下，各品種的龜甲幾乎無明顯蛋白條帶，難以進(jìn)行區(qū)分。故可以推測各品種龜甲分離出的蛋白在63 kDa以上的大分子量范圍內(nèi)很相似，可能有很多共同蛋白。若想計(jì)算某一蛋白條帶的蛋白分子量，對蛋白Marker條帶進(jìn)行遷移率的計(jì)算并與對應(yīng)的蛋白分子量做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程即可知道未知條帶的蛋白分子量。

注：1.為正品；5、3、6～14.為偽品。圖9 正品及混偽品龜甲電泳膠圖

正品龜甲(樣品1)除遵守上述規(guī)律外，還可以觀察到在42 kDa蛋白分子量附近，有明顯的蛋白條帶，以及在25 kDa附近，有兩條很細(xì)的顏色稍淺的蛋白條帶且?guī)缀踹B在一起，在21 kDa附近，有一條較粗的顏色稍深的蛋白條帶，在14～19 kDa，有3條高豐度蛋白聚合在一起，這“二細(xì)一粗三聚合”的條帶群，可以初步作為鑒別正品龜甲和其他龜甲混偽品的依據(jù)，因?yàn)橥ㄟ^上述多次平行及對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)正品龜甲的蛋白條帶均能滿足這一特點(diǎn)，故將這部分蛋白條帶與其他品種的龜甲進(jìn)行區(qū)分。

為了更好地觀察各品種龜甲的蛋白條帶，對所得膠圖蛋白條帶尤其是差異明顯的15～63 kDa部分進(jìn)行條帶歸類分析，有條帶記為1，無條帶記為0，以Marker及特征明顯的蛋白分子量為準(zhǔn)來觀察各品種龜甲在不同位置下是否也有同等分子量的蛋白條帶，具體信息見表3。

對比電泳膠圖及歸類整理后的蛋白條帶歸類表，可以發(fā)現(xiàn)蛋白分子量在63 kDa以上時(shí)無法將各品種龜甲鑒別開，且在135、130、65 kDa等蛋白分子量位置上，各品種龜甲均有相同條帶。對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，通過得到的聚類樹狀圖可以對上述12品種的龜甲蛋白條帶信息進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而更好地對龜甲及其混偽品進(jìn)行鑒別。分析見圖10。

表3 樣品蛋白條帶有無情況

圖10 龜甲及其混偽品藥材蛋白條帶聚類圖

聚類分析結(jié)果：以不同品種龜甲蛋白條帶譜的相似系數(shù)為距離，采用系統(tǒng)聚類法對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，得到的結(jié)果與膠圖的蛋白條帶以及對蛋白條帶的分析結(jié)果均相似，根據(jù)各品種(系)間遺傳距離的遠(yuǎn)近來統(tǒng)計(jì)分析，同一組內(nèi)各品種(系)間遺傳距離較近，不同組間各品種(系)遺傳距離較遠(yuǎn)。故樣品9、11為一組，7、8為一組，1、3為一組，這3組樣品的相似性較高，其次樣品6、12為一組，4、5為一組，這兩組樣品的相似性較差。

4 討論

對采集的不同產(chǎn)地及批次的多批正品龜甲藥材進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其分離得到的蛋白條帶幾乎相同，蛋白亞基條帶差異性很小，即同一品種的龜甲其蛋白分離得到的條帶難以受產(chǎn)地、批次等因素影響，有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

對聚類結(jié)果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)分到同一組的樣品可能由于種屬比較近似，如1號樣品烏龜為龜科水龜屬，3號樣品黃喉擬水龜為龜科擬水龜屬；7號樣品小鱷龜與8號樣品大鱷龜均為鱷龜科鱷龜屬，可能其相似性較多以至于電泳的條帶比較相似，因此將電泳得到的龜甲的蛋白條帶譜特征部分作為不同品種龜甲分類的補(bǔ)充依據(jù)的同時(shí)，要注意是否存在電泳條帶相似的黃喉擬水龜龜甲藥材。