李晶峰，王亞萍，邊學(xué)峰，張輝，孫佳明

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體[1]。僵蠶具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)的功效[2]，臨床上常用于肝陽上亢、高熱、痰濁、血虛、陰虛等所致的以肢體痙攣、抽搐、顫動(dòng)等為特點(diǎn)的證候，該證候與帕金森的臨床表現(xiàn)靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙相似。并且，僵蠶的辛散之力較強(qiáng)，有腥臭氣味[3-4]，患者直接服用生品會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐等反應(yīng)，故僵蠶服用前需要對(duì)其炮制來降低其腥臭味和刺激性。肽鍵熱振蕩理論認(rèn)為，動(dòng)物類藥材中活性肽在加熱炮制過程中，肽鍵的熱振蕩作用，導(dǎo)致肽鍵斷裂產(chǎn)生更多小分子肽段，其結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變，生理活性發(fā)生相應(yīng)的變化。本文基于僵蠶的傳統(tǒng)功效，重點(diǎn)針對(duì)體外抗帕金森病作用，依據(jù)肽鍵熱振蕩理論對(duì)僵蠶炮制前后的體外抗帕金森活性進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料

1.1 試藥

6-羥基多巴胺(6-OHDA)、維生素C、乙酰膽堿酯酶(AchE)、石杉?jí)A甲、5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸，DTNB)、碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)(Sigma公司)；磷酸緩沖鹽(PBS)、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)；牛血清蛋白(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、氫氧化鈉(NaOH)、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉(C4O6H4KNa)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)(北京化工有限公司)；麥麩(市售)；水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

僵蠶購買自吉林省百草大藥房，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為僵蠶。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購買自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 儀器

恒溫加熱燙板(常普天儀器制造有限公司)；紅外溫度檢測(cè)儀(華盛昌儀器實(shí)業(yè)有限公司)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SPECORD?200 PLUS紫外可見分光光度計(jì)(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；GL-20G-Ⅱ型低溫超速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電子天平(Sartorius)；Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器(江蘇太倉設(shè)備廠)；GZLY-0.4型藥用真空冷凍干燥機(jī)(北京速原中天科技有限公司)。

2 方法

2.1 僵蠶樣品的制備

2.1.1 僵蠶不同極性溶媒提取物的制備 僵蠶藥材粉碎過三號(hào)篩，得到藥材粗粉。稱取10 g僵蠶藥材粗粉加10倍量(100 mL)石油醚超聲提取1 h，過濾，濾液80 ℃水浴蒸干(石油醚提取物，S1)；待藥渣溶劑揮干后加8倍量(80 mL)乙酸乙酯超聲提取1 h，過濾，濾液蒸干(乙酸乙酯提取物，S2)；同上操作得到甲醇提取物(S3)、水提取物(S4)。

2.1.2 僵蠶不同組分的分離 依次使用截留量為10、3、1 kDa超濾離心管對(duì)僵蠶水提取液超濾，分別收集不同分子質(zhì)量的天然肽溶液，分級(jí)為>10 kDa、3～10 kDa、1～3 kDa、<1 kDa組分，冷凍干燥。

2.1.3 炒僵蠶的制備 稱取100 g僵蠶，將恒溫燙板的溫度設(shè)置為180 ℃，待溫度上升至所設(shè)溫度時(shí)倒入10 g麥麩，翻炒至麥麩起煙后，加入稱量好的僵蠶，炒制15 min。篩出麥麩，將炒制好的僵蠶放涼，粉碎過三號(hào)篩，得到炒僵蠶樣品，備用[3]。

2.1.4 僵蠶酶解品的制備 取僵蠶>10 kDa凍干粉5 mg溶于蒸餾水中，底物濃度為3%，100 ℃水浴加熱15 min，待溫度降至60 ℃，置于恒溫磁力攪拌器中，調(diào)至pH為9.0，加入酶底比為6%的胰蛋白酶，水解5 h后迅速轉(zhuǎn)入沸水浴中煮沸15 min滅酶，冷卻至室溫，3600 r·min-1離心20 min，收集上清液凍干。

2.2 對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)細(xì)胞保護(hù)作用的篩選研究

2.2.1 藥物的制備 僵蠶不同極性溶媒提取物及水提取物不同組分用DMEM培養(yǎng)液溶解，分別配成質(zhì)量濃度為0.1、0.05、0.025 mg·mL-1溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，備用。

2.2.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%新生胎牛血清、100 U·mL-1鏈霉素、100 μg·mL-1青霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞[5]。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，待SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，使細(xì)胞從瓶壁上分離下來，以1∶3～1∶4比例傳代。當(dāng)傳代細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.3.1 對(duì)6-OHDA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞增殖率的影響實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞接種到96孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104每孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，吸出舊的培養(yǎng)基，給藥組每孔加入100 μL不同濃度的樣品溶液，空白對(duì)照組每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，除去培養(yǎng)基，樣品組每孔加入100 μmol·mL-1的6-OHDA，空白對(duì)照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)液[6]，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加20 μL四唑鹽(MTT)[7]試液(5 mg·mL-1，PBS溶解)，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)液體吸出，每孔加入100 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀振蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A。

(1)

2.2.3.2 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞接種到96孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104每孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，吸出舊的培養(yǎng)基，然后每孔加入100 μL不同濃度的樣品溶液(DMEM培養(yǎng)液溶解)，空白對(duì)照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)液[6]，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加20 μL MTT試液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將液體吸出，每孔加入100 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀振蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A。

(2)

2.3 對(duì)抑制AchE活性的篩選

在96孔板中依次加入40 μL樣品溶液，80 μL PBS(0.1 mol·L-1，pH=8.0)，20 μL 5，5′-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB，2.5 mmol·L-1)及20 μL乙酰膽堿酯酶(AchE，0.25 U·mL-1，pH=8.0 PBS溶解稀釋)。37 ℃孵育10 min 后，加20 μL硫代乙酰膽堿(ATCI，1 mmol·L-1)。37 ℃孵育10 min后，用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)定其吸光度[8]，根據(jù)下式計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=[(A空白-A完全抑制)-(A樣品-A樣品空白)]/(A空白-A完全抑制)×100

(3)

其中，空白組用40 μL PBS(pH8.0)代替40 μL樣品溶液；完全抑制組用40 μL石杉?jí)A甲(10 μg·m L-1)代替40 μL樣品溶液。樣品空白組用20 μL PBS(pH8.0)代替20 μL AChE(0.25 U·mL-1，pH8.0 PBS溶解稀釋)。

2.4 三氯乙酸處理法測(cè)定寡肽含量

取僵蠶樣品1 mg溶于1 mL蒸餾水中，加入15%三氯乙酸溶液1 mL，搖勻，放置10 min，沉淀酸不溶性蛋白質(zhì)，置離心管中，4000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL樣品溶液為粗蛋白溶液[9]。

(4)

2.5 雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白含量

2.5.1 溶液配制 雙縮脲試劑：稱取0.075 g CuSO4·5H2O，0.25 g酒石酸鉀鈉，用25 mL水溶解，再加10% NaOH 15 mL，溶解后用水定容至50 mL，粗蛋白溶液見2.4。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟 見表1。

表1 雙縮脲法測(cè)定蛋白含量操作步驟

注：—為不加任何試劑。

混勻，放置30 min后，用分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定各管吸光度值。

(5)

(6)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 僵蠶不同極性溶媒提取物對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用篩選

模型組與空白對(duì)照組比較，存活率顯著降低(P<0.01)，S1在質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05 mg·mL-1時(shí)，S3在3個(gè)濃度下與模型組比較存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同濃度S4對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，可見水提取物對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，結(jié)果見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，n=5。圖1 僵蠶不同極性溶媒提取物對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

3.2 僵蠶活性組分篩選

3.2.1 僵蠶不同組分對(duì)AchE抑制活性的篩選 僵蠶水提物各組分在質(zhì)量濃度為2.5～10 mg·mL-1時(shí)對(duì)AchE均有一定的抑制力，且有劑量依賴性，其抑制作用從大到小依次為：<1 kDa、1～3 kDa、3～10 kDa、水提取物、>10 kDa，結(jié)果見圖2。

圖2 僵蠶不同組分對(duì)AchE抑制率的影響

3.2.2 僵蠶不同組分對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的篩選 根據(jù)僵蠶提取物的不同組分綜合考慮，除>10 kDa組分在0.025 mg·mL-1時(shí)有明顯毒性，其他組分質(zhì)量濃度在0.025～0.1 mg·mL-1時(shí)有明顯的增殖作用，見圖3A，故將僵蠶提取物的質(zhì)量濃度定在0.025、0.05、0.1 mg·mL-1進(jìn)行對(duì)6-OHDA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞增殖率影響實(shí)驗(yàn)。模型組與空白對(duì)照組比較細(xì)胞增殖率顯著性降低(P<0.05)，與模型組比較，<1 kDa組分在質(zhì)量濃度為0.05～0.1 mg·mL-1時(shí)細(xì)胞增殖率有顯著性升高(P<0.01)，1～3 kDa 組分在質(zhì)量濃度為0.05、0.1 mg·mL-1時(shí)有顯著性升高(P<0.05)，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)的為<1 kDa組分，結(jié)果見圖3B。

注：A.僵蠶不同組分對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)；B.僵蠶不同組分對(duì)6-OHDA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，n=5。圖3 僵蠶不同組分對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響

3.3 炮制前后僵蠶毒性對(duì)比

取僵蠶5個(gè)不同組分分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的樣品，僵蠶>10 kDa組分在0.5 mg·mL-1濃度下，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率為79.52%，對(duì)細(xì)胞有明顯的殺傷作用；炒僵蠶>10 kDa組分在0.5 mg·mL-1濃度下SH-SY5Y細(xì)胞的存活率為91.42%，對(duì)細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用，并有一定的增殖作用，其他組分在質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞均無明顯殺傷作用，通過在相同濃度下對(duì)細(xì)胞造成的損傷程度比較，結(jié)果表明，僵蠶經(jīng)過炮制后毒性降低，符合炮制使其減毒的目的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 僵蠶與炒僵蠶對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

3.4 炮制前后僵蠶<1 kDa組分活性對(duì)比

僵蠶及炒僵蠶<1 kDa組分在質(zhì)量濃度為2.5～10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)AchE有一定的抑制作用。相同濃度下僵蠶寡肽對(duì)AchE的抑制率略高于炒僵蠶寡肽，結(jié)果見圖5A。僵蠶對(duì)SH-SY5Y保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，

注：A.僵蠶及炒僵蠶寡肽對(duì)AchE的抑制率；B.僵蠶及炒僵蠶寡肽對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，n=5。圖5 僵蠶炮制前后不同組分對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，僵蠶<1 kDa組分在質(zhì)量濃度為0.125～0.5 mg·mL-1時(shí)對(duì)損傷SY5Y細(xì)胞有顯著的增殖作用(P<0.01)，在質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)有增殖率最大，達(dá)到63.95%；炒僵蠶<1 kDa組分在質(zhì)量濃度為0.25～0.5 mg·mL-1時(shí)對(duì)損傷SY5Y細(xì)胞有顯著的增殖作用(P<0.05)，綜上所述，炒僵蠶<1 kDa組分對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用弱于僵蠶，結(jié)果見圖5B。

3.5 炮制前后僵蠶寡肽含量的對(duì)比

分別對(duì)僵蠶炮制前后總提取物蛋白含量及<1 kDa組分寡肽含量進(jìn)行比較，僵蠶炮制后蛋白含量降低，但炒僵蠶<1 kDa組分的寡肽含量及收率均高于僵蠶，推測(cè)原因可能是經(jīng)過肽鍵熱振蕩作用使蛋白質(zhì)的肽鍵發(fā)生斷裂，生成小分子肽段，炮制后活性下降可能是>10 kDa蛋白含量下降和<1 kDa寡肽含量升高的綜合作用結(jié)果。

注：A.炮制前后蛋白含量對(duì)比；B.炮制前后寡肽收率比較。圖6 僵蠶炮制前后蛋白含量、寡肽收率的比較

3.6 炮制前后僵蠶天然與酶解<1 kDa組分活性及寡肽含量對(duì)比

炮制前后僵蠶天然與酶解<1 kDa組分質(zhì)量濃度為2.5～10 mg·mL-1，隨著濃度的增加對(duì)AchE的抑制率隨之增加，在相同濃度下進(jìn)行對(duì)比，天然<1 kDa組分對(duì)AchE的抑制率強(qiáng)于酶解<1 kDa組分，但差別不大，結(jié)果見圖7A。炮制前后僵蠶天然<1 kDa組分的活性均高于酶解<1 kDa組分，但酶解寡肽的收率高于天然寡肽，僵蠶酶解寡肽為天然寡肽的1.31倍，炒僵蠶酶解寡肽收率為天然寡肽的1.67倍，結(jié)果見圖7B。

注：A.炮制前后僵蠶天然與酶解<1 kDa組分對(duì)AchE的抑制率影響；B.炮制前后天然寡肽與酶解寡肽含量對(duì)比。圖7 僵蠶炮制前后天然與酶解<1 kDa組分活性及寡肽含量比較

4 討論

僵蠶是一種蟲類動(dòng)物藥，研究多集中在僵蠶品質(zhì)、炮制工藝等方面[10-12]，對(duì)其活性研究較少。其具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)的功效，結(jié)合相關(guān)癥狀，有文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]僵蠶與其他中藥配伍治療帕金森的經(jīng)驗(yàn)，為了進(jìn)一步研究僵蠶治療帕金森疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文篩選了僵蠶體外抗帕金森的活性部位。

6-OHDA誘導(dǎo)體外細(xì)胞SH-SY5Y損傷模型最常用于帕金森(PD)的發(fā)病機(jī)制和藥物療效的研究[15-19]。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是帕金森病病理機(jī)制中神經(jīng)元死亡的病因之一，AchE可以在膽堿能神經(jīng)突觸部位和神經(jīng)肌肉接頭終止膽堿能神經(jīng)信號(hào)的傳遞，并且在誘導(dǎo)各種類型的細(xì)胞系凋亡的過程中，都有AchE的表達(dá)增加，提示AchE可能參與了PD發(fā)病過程中的神經(jīng)元凋亡。故本文應(yīng)用上述兩個(gè)指標(biāo)來篩選活性成分[20-22]。

為了篩選僵蠶治療帕金森病活性組分，本文應(yīng)用6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型對(duì)其全成分(僵蠶不同極性溶媒提取物)進(jìn)行系統(tǒng)研究，經(jīng)活性篩選表明，其水提取物活性最強(qiáng)。進(jìn)而根據(jù)不同分子量對(duì)僵蠶水提取物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，5個(gè)組分中的活性最強(qiáng)的為<1 kDa組分。

本文基于肽鍵熱振蕩理論對(duì)僵蠶炮制前后的化學(xué)成分與毒性、活性變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明，僵蠶麩炒后，總蛋白含量下降，總寡肽含量升高，表明經(jīng)肽鍵熱振蕩作用肽鍵斷裂，產(chǎn)生了更多的寡肽成分，且僵蠶>10 kDa組分對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有抑制增殖作用，但炒僵蠶>10 kDa組分對(duì)SH-SY5Y無明顯抑制增殖作用。說明炮制后毒性降低，同時(shí)活性略有下降，這可能是具有一定毒性的蛋白含量下降和活性寡肽含量升高的綜合作用結(jié)果。將天然與酶解<1 kDa組分進(jìn)行AchE抑制及寡肽收率方面進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天然寡肽的活性略強(qiáng)于酶解寡肽，但酶解寡肽的收率要高于天然寡肽，在工業(yè)上酶解寡肽可代替天然寡肽。