蘇燕燕，丁丹丹，馬婷玉，向麗

中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所 中藥鑒定與安全性檢測(cè)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

蛤蚧為我國名貴動(dòng)物中藥材，其基原為壁虎科Gekkonidae壁虎屬動(dòng)物蛤蚧(又名大壁虎)GekkogeckoLinnaeus，以除去內(nèi)臟的干燥全體入藥，具有止咳、平喘、保肝、降血糖、提高機(jī)體免疫力及激素樣作用[1-4]，為臨床常用補(bǔ)虛藥[5-6]。因市場(chǎng)需求增大、人們大肆捕捉及生存環(huán)境的改變，蛤蚧野生資源驟減，現(xiàn)已列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物和廣西省一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，市場(chǎng)上蛤蚧多為進(jìn)口和養(yǎng)殖。由于蛤蚧、藏蛤蚧等形態(tài)相似，導(dǎo)致同名異物、同物異名的情況較為嚴(yán)重，市場(chǎng)常見壁虎、藏蛤蚧、石龍子、蜥蜴等混偽品[7-11]。近年來，越來越多的蛤蚧粉、蛤蚧膠囊等未經(jīng)檢驗(yàn)的藥材在電商平臺(tái)出售，嚴(yán)重威脅臨床用藥安全，亟需一種準(zhǔn)確高效的鑒別方法規(guī)范藥材市場(chǎng)、保障藥材安全。

高分辨率熔解曲線(High Resolution Melting，HRM)技術(shù)是指采用飽和熒光染料，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過核酸熔解曲線分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)、基因型分析的新型分子診斷技術(shù)[12-14]。因其具有靈敏度高、檢測(cè)快速、閉管操作避免污染、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)、可選擇性測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于基因突變掃描、基因型分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等研究[15-18]。此外，結(jié)合DNA barcoding的Bar-HRM技術(shù)逐漸形成，并成功應(yīng)用于沙棘、蜂蜜等中藥、食品的鑒定研究中，具有重要應(yīng)用價(jià)值[19-21]。

目前，蛤蚧相關(guān)的HRM鑒定研究未見報(bào)道，而動(dòng)物通用條形碼線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase subunit I，COI)序列長(zhǎng)度大于600 bp，相較之下，片段長(zhǎng)度約400 bp且能實(shí)現(xiàn)蛤蚧與混偽品鑒別的12S核糖體核糖核酸(Ribosomal Ribonucleic Acid，rRNA)基因序列則更為適宜[22-25]。因此，本研究以蛤蚧與其6種常見混偽品為研究對(duì)象[11，26-27]，基于12S rRNA序列對(duì)其進(jìn)行HRM鑒別研究，并對(duì)市售蛤蚧粉進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的可行性，完善了中藥蛤蚧的分子快速鑒定體系。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究所用動(dòng)物樣品共48份，其中，蛤蚧10批次30份；蛤蚧常見混偽品無蹼壁虎Gekkoswinhonis、疣尾蜥虎Hemidactylusfrenatus、喜山巖蜥Laudakiahimalayana、石龍子Eumeceschinensis、東方蠑螈Cynopsorientalis和紅瘰疣螈Tylototritonshanjing各3份。此外，購買市售蛤蚧粉10份。動(dòng)物樣品均經(jīng)中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所蔣珂助理研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。本研究共得48條12S rRNA序列，均已提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(表1)。

表1 蛤蚧及其混偽品樣品信息

1.2 儀器及試劑

Scientz-48高通量組織研磨儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Qubit 3.0熒光定量?jī)x[賽默飛世爾(美國)科技有限公司]；Rotor-Gene Q MDx實(shí)時(shí)定量PCR儀[凱杰(德國)生物技術(shù)有限公司]；血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；HRM分析試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；T-A克隆試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

2 方法

2.1 DNA提取

采用試劑盒法提取樣品總DNA[26]。所有樣品DNA均利用Qubit 3.0測(cè)定濃度，并調(diào)整為30～50 ng·μL-1。采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA質(zhì)量，OD260/280處于1.8～2.0的為優(yōu)質(zhì)；保存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 蛤蚧12S rRNA序列擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析

以10批次蛤蚧樣品DNA為模板，進(jìn)行12S rRNA序列擴(kuò)增[24]，采用凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，送北京諾賽基因組研究中心有限公司雙向測(cè)序。

通過軟件CodonCode Aligner V3.0對(duì)10批次蛤蚧的12S rRNA序列峰圖進(jìn)行拼接剪切，在NCBI比對(duì)驗(yàn)證后采用MEGA 6.0進(jìn)行序列分析。

2.3 蛤蚧及其混偽品HRM-PCR擴(kuò)增與Bar-HRM數(shù)據(jù)分析

以10批次蛤蚧的主要單倍型和6種常見混偽品的DNA為檢測(cè)對(duì)象。

HRM-PCR體系為25 μL，包含2×HRM PCR master mix 12.5 μL，正反向引物L(fēng)1091/H1478(2.5 μmol·L-1)各1 μL，以1 μL DNA為模板，加RNase-Free Water補(bǔ)充至25 μL。

HRM-PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；PCR反應(yīng)完成后進(jìn)入擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM曲線分析程序：熔解溫度從75 ℃逐漸升至95 ℃，每變化0.15 ℃收集一次熒光信號(hào)。蛤蚧及其混偽品的HRM-PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

2.4 蛤蚧及其混偽品Bar-HRM數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中獲得的高分辨率熔解曲線均通過Rotor-Gene Q MDx version 2.3.1.49(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)進(jìn)行分析；蛤蚧與其6種常見混偽品的HRM-PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，并采用MEGA 6.0進(jìn)行序列分析。

2.5 靈敏度檢測(cè)

任取1份蛤蚧DNA，將質(zhì)量濃度調(diào)整為50 ng·μL-1，并稀釋為25、10、5、1 ng·μL-1的DNA溶液，進(jìn)行HRM-PCR實(shí)驗(yàn)，研究DNA模板濃度與鑒定結(jié)果的關(guān)系。

2.6 蛤蚧摻偽檢測(cè)

以0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的比例將無蹼壁虎DNA與蛤蚧DNA混合，以摻偽DNA為模板進(jìn)行HRM-PCR擴(kuò)增，設(shè)蛤蚧為對(duì)照樣品，研究DNA摻偽比例與HRM曲線的關(guān)系。

2.7 市場(chǎng)蛤蚧粉鑒定

在市場(chǎng)購買10份蛤蚧粉，取樣約45 mg，以試劑盒法提取總DNA。利用HRM技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)：每份設(shè)置3個(gè)物理重復(fù)，以蛤蚧對(duì)照藥材DNA為陽性對(duì)照，并測(cè)序驗(yàn)證。針對(duì)出現(xiàn)套峰的樣品進(jìn)行T-A克隆檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 蛤蚧12S序列分析

10批次30條蛤蚧12S rRNA序列，長(zhǎng)度均為396 bp，可分為2種單倍型(圖1)，其中，單倍型H1有21條，單倍型H2有9條；共存在5個(gè)變異位點(diǎn)，分別為64位點(diǎn)的C-T變異，211位點(diǎn)的T-A變異，228位點(diǎn)的C-T變異，325位點(diǎn)的G-A變異和358位點(diǎn)的A-G變異。表明序列較為保守。

3.2 蛤蚧及其混偽品HRM分析

因10批次30份蛤蚧樣品中僅存在2種單倍型，因此，每種單倍型任選3份DNA與6種混偽品共同進(jìn)行HRM實(shí)驗(yàn)。根據(jù)圖2可知，蛤蚧與6種混偽品的12S rRNA-HRM曲線均具有不同的形狀特點(diǎn)，在歸一化熔解曲線(圖2A)和差異化熔解曲線(圖2B)中，蛤蚧的2種單倍型均可區(qū)分開，但相對(duì)于無蹼壁虎、疣尾蜥虎、喜山巖蜥、石龍子、東方蠑螈和紅瘰疣螈6種混偽品，蛤蚧的2種HRM曲線聚在一起。無蹼壁虎、石龍子和紅瘰疣螈的HRM曲線分別只有一種，表明這3個(gè)物種分別只有一種單倍型。而3份疣尾蜥虎的HRM曲線呈現(xiàn)出相近的2種，則

注：H1和H2表示不同單倍型。圖1 蛤蚧不同單倍型12S rRNA序列

該樣品的12S rRNA序列有2種單倍型；3份東方蠑螈和3份喜山巖蜥(藏蛤蚧)的HRM曲線均出現(xiàn)較小的差異，可能存在序列差異很小的不同單倍型，或者因?qū)嶒?yàn)操作中加樣量不均一而導(dǎo)致曲線出現(xiàn)微小差異，需測(cè)序驗(yàn)證?？傮w而言，蛤蚧及其6種常見混偽品均可通過HRM曲線進(jìn)行鑒別區(qū)分。

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化熔解曲線。圖2 基于12S rRNA序列蛤蚧與常見混偽品的HRM曲線

3.3 蛤蚧及其混偽品DNA barcoding分析

所有HRM-PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)共得48條12S rRNA序列，其中蛤蚧30條，混偽品18條，所有12S rRNA序列均在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)驗(yàn)證，比對(duì)到的最相近物種為自身物種，比對(duì)值為99%～100%。序列特征見表2。蛤蚧和6種常見混偽品的序列長(zhǎng)度均小于400 bp，其中，無蹼壁虎的序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為399 bp；喜山巖蜥的最短，為362 bp；蛤蚧的序列長(zhǎng)度為396 bp。7個(gè)物種的平均GC堿基含量(鳥嘌呤G和胞嘧啶C在DNA 4種堿基中所占的比率)在40%～50%，其中，疣尾蜥虎的平均GC堿基含量最高，為50.0%；東方蠑螈的最低，為41.4%；蛤蚧的平均GC堿基含量為43.5%。

在本研究的7個(gè)物種中，無蹼壁虎、石龍子、東方蠑螈和紅瘰疣螈共4個(gè)物種的12S rRNA序列分別只有1種單倍型，種內(nèi)無變異位點(diǎn)，序列較為保守；蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山巖蜥分別有2種單倍型，其中，蛤蚧的12S rRNA序列含5個(gè)變異位點(diǎn)，喜山巖蜥有1個(gè)變異位點(diǎn)，疣尾蜥虎存在18個(gè)變異位點(diǎn)，種內(nèi)差異較大；與HRM曲線分析結(jié)果相符。根據(jù)種內(nèi)、種間遺傳距離分析結(jié)果顯示，7個(gè)物種的種內(nèi)最大遺傳距離均小于其種間最小遺傳距離，表明蛤蚧及其6種混偽品可通過遺傳距離分析進(jìn)行鑒別。此外，在NJ樹圖中(圖3)，蛤蚧和6種常見混偽品分別聚為一支，而且，自展支持率都高達(dá)99%，表明，蛤蚧及6種常見混偽品可通過構(gòu)建NJ樹準(zhǔn)確區(qū)分。

因此，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，基于12S rRNA序列的DNA barcoding分析，蛤蚧與其6種常見混偽品可準(zhǔn)確鑒別，而且各物種間也能準(zhǔn)確區(qū)分，與HRM曲線分析結(jié)果相符，表明基于12S rRNA序列的HRM技術(shù)可實(shí)現(xiàn)蛤蚧及其6種常見混偽品的準(zhǔn)確區(qū)分。

3.4 靈敏度分析

為研究DNA濃度對(duì)鑒定效果的影響，將蛤蚧DNA濃度調(diào)整為50、25、10、5、1 ng·μL-1，以此系列濃度DNA為模板進(jìn)行HRM-PCR擴(kuò)增。圖4顯示不同濃度蛤蚧樣品的HRM曲線聚在一起(圖4A)，Tm值為(81.11±0.03)℃(圖4B)，表明DNA濃度為1～50 ng·μL-1的蛤蚧樣品均可通過HRM-PCR檢出，且結(jié)果穩(wěn)定。

表2 蛤蚧及常見混偽品12S rRNA序列特征

注：bootstrap 1000次重復(fù)，僅顯示自展支持率≥50%。圖3 基于12S rRNA序列蛤蚧及其混偽品的系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹

注：A.歸一化熔解曲線；B.DNA熔解曲線。圖4 基于12S rRNA序列蛤蚧HRM曲線靈敏度檢測(cè)

3.5 摻偽檢測(cè)

設(shè)置0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的DNA摻偽比例(無蹼壁虎/蛤蚧)，研究HRM技術(shù)對(duì)物種的檢出能力。不同摻偽比例得到的曲線不同(圖5)，以蛤蚧的HRM曲線為基準(zhǔn)，曲線相似性隨著摻偽比例的增大而降低，當(dāng)摻偽比例為1%時(shí)，該HRM曲線的相似性為99.07%(表3)。結(jié)果表明，基于12S r RNA序列的HRM曲線可實(shí)現(xiàn)蛤蚧的摻偽檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)1%；而且，曲線相似性分析結(jié)果，對(duì)推算摻偽比例具有一定指導(dǎo)意義。

表3 不同摻偽比例HRM曲線基因型置信百分比 %

3.6 市場(chǎng)蛤蚧粉鑒定

在市場(chǎng)購買了10份蛤蚧粉，以基于12S rRNA序列的HRM技術(shù)其進(jìn)行初步檢測(cè)，以鑒定其真?zhèn)?。每份樣品進(jìn)行3個(gè)物理重復(fù)，10份蛤蚧粉得30條HRM曲線(圖6)。其中，SY8的3條曲線單獨(dú)聚在一起，SY4、SY5、SY7的9條曲線聚為一類，其余6份樣品的18條HRM曲線聚為另一類，沒有與已知蛤蚧12S rRNA序列完全相同的樣品。推測(cè)曲線聚為一起的蛤蚧粉來源接近。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，10份蛤蚧粉的測(cè)序峰圖均出現(xiàn)不同程度的套峰，具體表現(xiàn)為部分位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，底峰較高。對(duì)出現(xiàn)套峰的樣品進(jìn)行T-A克隆檢測(cè)，10份市場(chǎng)蛤蚧粉均檢測(cè)到多種蛤蚧單倍型，表明所購蛤蚧粉為混合樣品。

此外，SY1、SY2、SY3、SY6、SY9、SY10曲線呈現(xiàn)異常，經(jīng)Qubit 3.0測(cè)定DNA濃度低于1 ng·μL-1，表明DNA降解嚴(yán)重，其原因可能為：炮制過程中溫度過高或時(shí)間過久；藥材存放時(shí)間較久；藥材肌肉組織含量少，如去尾后的蛤蚧。而且，經(jīng)多次T-A克隆檢測(cè)，比對(duì)到羽螨屬Proctophyllodessp.物種和黑糞蚊。樣品疑似不潔。結(jié)合價(jià)格分析，SY6價(jià)格最低，為0.39元/g，另外5份售價(jià)為0.67～0.74元/g；而SY4、SY5、SY7和SY8的售價(jià)分別為0.60、0.56、0.56、1.60元/g，檢測(cè)結(jié)果無異常。推測(cè)SY1、SY2、SY3、SY9、SY10有以次充好的可能。

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化熔解曲線；C.DNA熔解曲線。圖5 基于12S rRNA序列蛤蚧摻偽檢測(cè)HRM曲線

注：A.歸一化熔解曲線；B.以蛤蚧為參考基因型的差異化曲線；C.DNA熔解曲線。圖6 市售蛤蚧粉HRM曲線

4 討論

蛤蚧作為我國名貴動(dòng)物中藥材，相關(guān)鑒定研究多有報(bào)道，常用鑒定方法為形態(tài)鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等傳統(tǒng)鑒定方法[11，28-29]。形態(tài)鑒定和顯微鑒定均需要長(zhǎng)期從事中藥鑒定工作的專家完成，專業(yè)難度大，不易掌握；目前未發(fā)現(xiàn)蛤蚧的專屬特征性成分，《中華人民共和國藥典》中也未收載相關(guān)成分的含量測(cè)定方法，鑒定難度大。

目前，以DNA barcoding和特異性PCR方法為代表的分子鑒別技術(shù)較為高效。張紅印、GU等[26，30]均通過COI序列對(duì)蛤蚧及其10種易混物種和偽品進(jìn)行了DNA barcoding鑒定研究，也有學(xué)者基于蛤蚧及其多種混偽品的COI、16S rRNA、Cytb、12S rRNA片段設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行鑒別[25，27，31-32]。但是，DNA barcoding技術(shù)的精準(zhǔn)鑒定主要依賴于PCR產(chǎn)物的測(cè)序，若大宗中藥材均采用測(cè)序檢測(cè)，一則檢測(cè)周期延長(zhǎng)，二則測(cè)序成本高。而且，存放較久的樣品、炮制品以及深加工后的中成藥，因DNA降解，很難經(jīng)傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增到較長(zhǎng)的DNA片段，如700 bp左右的COI序列。特異性PCR檢測(cè)方法對(duì)于摻偽品則無法準(zhǔn)確鑒別。

本研究以蛤蚧與其6種常見混偽品為研究對(duì)象，采用HRM技術(shù)進(jìn)行鑒定研究。HRM技術(shù)靈敏度高，理論上可實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的差異分析，且檢測(cè)快速[12，18，33]。結(jié)果顯示，蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山巖蜥分別生成了2種峰型的熔解曲線，推測(cè)存在不同的單倍型，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，與熔解曲線分析結(jié)果相符。因此，通過HRM鑒別，可實(shí)現(xiàn)同一個(gè)物種不同單倍型的區(qū)分，檢測(cè)靈敏度和特異性較強(qiáng)。而且，經(jīng)Barcoding驗(yàn)證分析，蛤蚧與6種混偽品均能通過BLAST分析、遺產(chǎn)距離分析、NJ樹分析區(qū)分開，表明蛤蚧及其6種常見混偽品可通過基于12S rRNA序列的Bar-HRM方法進(jìn)行高效鑒別。

基于12S rRNA序列，對(duì)蛤蚧和無蹼壁虎進(jìn)行摻偽檢測(cè)，根據(jù)曲線相似性分析，摻偽比例為1%時(shí)，曲線相似性為99%，表明摻偽最低檢測(cè)限可達(dá)1%。而Sakaridis等[34]針對(duì)驢肉的摻偽檢測(cè)研究，顯示出了更高的靈敏度，最低摻偽比例僅為0.1%。雖然不同物種、不同片段的擴(kuò)增偏好性不同，但曲線相似性分析結(jié)果，對(duì)于評(píng)估藥材是否摻偽及摻偽比例仍具有一定參考價(jià)值。經(jīng)對(duì)10份市場(chǎng)蛤蚧粉檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中6份DNA濃度較低，且在后續(xù)T-A克隆檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)螨屬和黑糞蚊物種，疑似存放不當(dāng)，造成污染。

本研究基于12S rRNA序列建立的蛤蚧的Bar-HRM鑒別方法，為蛤蚧的快速鑒別、蛤蚧藥材的摻偽檢測(cè)及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的技術(shù)支持，但蛤蚧的12S rRNA序列長(zhǎng)度約為400 bp，對(duì)于深加工后的相關(guān)產(chǎn)品則很難檢測(cè)，還需進(jìn)一步開發(fā)片段進(jìn)行研究。