張紅印，金平，劉冬，高曉晨，張輝

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117

中藥海龍?jiān)谖覈?guó)有悠久的應(yīng)用歷史，是常用的名貴珍稀動(dòng)物藥之一，具有溫腎壯陽、散結(jié)消腫的功效。首載于《本草綱目拾遺》，表述其藥效“功倍海馬”。2015版《中華人民共國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)中規(guī)定，海龍藥材為海龍科動(dòng)物刁海龍SolenognathushardwickiiGray、擬海龍SyngnathoidesbiaculeatusBloch或尖海龍SyngnathusacusLinnaeus的干燥體[1]。于夏、秋二季捕撈；刁海龍、擬海龍，洗凈，除去皮膜，曬干；尖海龍個(gè)體較小直接洗凈，曬干。

隨著人們生活水平的提高，健康意識(shí)的增強(qiáng)，中醫(yī)藥保健應(yīng)用已成為我國(guó)人民的日常需求，海龍、海馬等海洋中藥，在補(bǔ)益身體使用上由來已久，據(jù)相關(guān)研究表明，海龍藥材含有豐富的生物活性成分，包括總甾體類化合物、蛋白質(zhì)、人體必需氨基酸、微量元素鋅、錳、銅等[2]。具有溫腎壯陽、延緩衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、加強(qiáng)心肌收縮力、緩解骨質(zhì)疏松、降低膽固醇、治療老年性癡呆癥等作用[3-6]。但隨著市場(chǎng)需求逐年增加，海龍野生資源的緊缺，價(jià)格持續(xù)增長(zhǎng)，市售海龍藥材中出現(xiàn)了摻偽、摻假等現(xiàn)象，2015版《中國(guó)藥典》未收錄的不同來源海龍藥材銷售比例逐年加大，致使海龍藥材市場(chǎng)流通混亂。常見的混偽品有寶珈海龍MicrophisboajaBleeker、粗吻海龍TrachyrhamphusserratusTemminck et schlegel、海蠋魚HalicampuskoilomatodonBleeker和貢氏柄領(lǐng)海龍SolenognathusguntheriDunjker等種類[7]。

中藥材DNA條形碼鑒定技術(shù)是20世紀(jì)新興的分子鑒定手段，其基于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的特點(diǎn)，與最新的分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，突破了傳統(tǒng)的中藥鑒定技術(shù)手段，在基因分子水平對(duì)藥材來源進(jìn)行分析，達(dá)到了準(zhǔn)確、快速鑒別中藥材真?zhèn)蔚哪康腫8]。隨著關(guān)注度的持續(xù)增長(zhǎng)，相關(guān)研究和實(shí)驗(yàn)技術(shù)已日益完善，已于2014年被增錄到2010版《中國(guó)藥典》(增補(bǔ)版)中，并被2015版《中國(guó)藥典》第四部正式收錄，成為了具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的中藥鑒定新手段[9]。DNA條形碼鑒定技術(shù)，不限于藥材來源物種的生長(zhǎng)周期和形態(tài)學(xué)變化影響，能夠有效改善傳統(tǒng)鑒定技術(shù)鑒定周期長(zhǎng)、適用性低的特點(diǎn)，有效維護(hù)中藥材流通的正常秩序，為人們的健康生活提供保障。本項(xiàng)目通過前期文獻(xiàn)研究考察，擬定了海龍樣品采集計(jì)劃，并通過中藥材DNA條形碼鑒定技術(shù)對(duì)海龍及其市售樣品進(jìn)行鑒別，以達(dá)到快速、高效鑒別海龍的目的。

1 材料

1.1 儀器

PCR儀(Bio-Rad，USA)；1-14K型高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；球磨儀(Retsch MM400，Germany)；Nano Drop 2000/2000C分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)；微量移液器(Eppendorf，Germany)；凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 樣品

本實(shí)驗(yàn)共收集海龍及其混偽品7個(gè)物種129份樣品(見表1)和66條來自GenBank數(shù)據(jù)庫的樣品序列(見表2)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定，憑證樣本保存于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)。

表1 海龍及其混偽品樣品信息

表2 GenBank來源序列信息

2 方法

2.1 DNA提取

對(duì)收集到的海龍樣品，用75%乙醇擦拭表面后，采用紫外燈照射消毒。取樣品腹部部位時(shí)，需用手術(shù)刀片刮去內(nèi)外腐爛殘留，避免污染；取樣品尾部部位時(shí)，刮去樣品表皮即可。取樣量約為40 mg，用球磨儀研磨2 min(30次/s)，樣品DNA使用血液、細(xì)胞、組織基因組提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.Ltd.，China)進(jìn)行提取。因海龍蛋白含量較高，在樣品裂解消化結(jié)束后，加入1.5倍體積的三氯甲烷-異戊醇(24∶1)溶液，充分混勻，離心(12 000 r·min-1，5～10 min)，用于去除蛋白類雜質(zhì)，防止對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。所得樣品DNA，采用NanoDrop 2000/2000c紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得的樣品濃度和A260/A280比值判斷樣品DNA質(zhì)量。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增引物采用中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則規(guī)定的COI序列通用引物[9-10]，正向引物為HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，反向引物L(fēng)CO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；PCR反應(yīng)體系為25 μL體系，包含2×TaqPCR Mix(Takara Bio，China)12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL、引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)(Sangon Biotech Co.，Ltd.，China)，樣品DNA約2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min，開啟1循環(huán)，94 ℃變性1 min，45 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，共5循環(huán)；開啟2循環(huán)，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用ABI3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Co.，USA)進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 序列處理及結(jié)果分析

測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V8.0.2(CodonCode Co.，USA)和DNA man(Lynnon Biosoft，USA)拼接并校正，切除正反引物，獲得長(zhǎng)度為650 bp左右的樣品序列，對(duì)于從GenBank獲得的COI序列，通過分析軟件，與所得的海龍樣品序列比對(duì)后，切除與海龍樣品序列相對(duì)應(yīng)以外的區(qū)段，保留長(zhǎng)度≥600 bp的有效序列。最后將全部序列用MEGA7.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析軟件比對(duì)，基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

3 結(jié)果

3.1 海龍藥材樣品DNA提取與PCR擴(kuò)增

海龍及其市售藥材均以干燥體出售，部分藥材經(jīng)過晾曬、烘干處理，導(dǎo)致藥材DNA出現(xiàn)了不同程度的降解，本實(shí)驗(yàn)所提取的海龍樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示部分樣品條帶呈彌散狀，表明DNA有一定程度降解。海龍所有樣本均可以成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見圖1。

注：M.Marker；CK.空白對(duì)照；1～8.海龍樣品。圖1 部分海龍樣品的PCR擴(kuò)增電泳圖

3.2 海龍種內(nèi)及種間變異分析

海龍及其混偽品COI序列片段長(zhǎng)度為658 bp。刁海龍不同來源樣品共16份，變異位點(diǎn)較少，在622 bp位置A-G變異；擬海龍不同來源樣品共16份，變異位點(diǎn)較少，在641 bp位置G-A變異。尖海龍不同來源樣品共16條，變異位點(diǎn)較少，在547 bp位置C-T變異。混偽品寶珈海龍不同來源樣品共35份，變異位點(diǎn)較少，在301 bp位置C-T變異，511 bp位置G-A變異，512 bp位置A-G變異；粗吻海龍不同來源樣品共45份，在44、345、502 bp位置C-T變異，249 bp位置T-C變異，312、315、432、627 bp位置A-G變異，351、513 bp位置G-A變異；海蠋魚共6份，在103、178、265、550 bp位置T-C變異，100、322 bp位置G-A變異。貢氏柄領(lǐng)海龍不同來源樣品共4條?；贙2P模型計(jì)算遺傳距離，3種正品海龍藥材來源種內(nèi)最大K2P距離均小于0.017，種內(nèi)平均K2P距離為0.005，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于海龍藥材與其混偽品序列種間最小K2P距離。

3.3 海龍及其混偽品的序列鑒定

通過鄰接(NJ)法利用所得實(shí)驗(yàn)序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中序列所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹(見圖2)可以看出，海龍藥材不同來源個(gè)體均聚在一起，單獨(dú)聚為一支，具有明顯單系性，各類混偽品的對(duì)應(yīng)序列也分別單獨(dú)聚為一支。因此，COI序列條形碼可準(zhǔn)確鑒別海龍及其混偽品。

圖2 海龍及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap 1000次重復(fù))

4 討論

4.1 海龍及其混偽品樣品DNA提取

海龍質(zhì)地堅(jiān)韌，骨質(zhì)化程度高，提取DNA時(shí)，難以裂解完全，且市售海龍均經(jīng)過曬干和烤干等炮制處理；部分商家為使樣品美觀，還進(jìn)行了熏硫漂白，致使DNA含量減少。本研究經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，按DNA提取試劑盒說明操作，所得樣品DNA質(zhì)量不能達(dá)到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求，因此對(duì)DNA提取試劑盒操作進(jìn)行部分優(yōu)化，成功獲得了較為理想的樣品DNA。樣品前處理時(shí)，使用工具清除樣品外皮及內(nèi)臟殘留，用75%乙醇進(jìn)行表面擦拭，紫外燈照射消毒處理，防止外源性污染；提取DNA時(shí)，增加了GA、GB、蛋白酶K的加入量和樣品的裂解時(shí)間，以達(dá)到更好的裂解效果，在裂解完成后加入1.5倍體積的三氯甲烷-異戊醇(24∶1)進(jìn)行抽提，12 000 r·min-1離心5～10 min，吸取上層清液。

4.2 DNA條形碼鑒定技術(shù)在動(dòng)物藥鑒定中的應(yīng)用

2015版《中國(guó)藥典》中共收錄了51種動(dòng)物藥，包含76種藥用動(dòng)物來源，所收錄的動(dòng)物類藥除鹿類、蛤蚧、烏梢蛇、水蛭、中華大蟾蜍等已具備規(guī)范化養(yǎng)殖外，其余大部分藥材來源還是以野生資源為主，如穿山甲、海龍、海馬等，隨著野生資源的大量開發(fā)，藥源逐漸緊缺，致使價(jià)格持續(xù)增長(zhǎng)，為追求利益，藥材市場(chǎng)上混偽品充斥現(xiàn)象較為普遍，嚴(yán)重?cái)_亂了藥材市場(chǎng)秩序，增加了臨床用藥的安全隱患。中藥材DNA條形碼鑒定方法的提出，有效補(bǔ)充了傳統(tǒng)中藥鑒定方法的不足，在名貴動(dòng)物藥鑒定中的作用尤為重要。賈靜等[11]基于DNA條形碼分子鑒定技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)名貴珍稀動(dòng)物藥穿山甲進(jìn)行了成功鑒別，并對(duì)穿山甲常見的混偽品進(jìn)行了序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，DNA條形碼鑒定技術(shù)能夠有效鑒別穿山甲及其混偽品。張改霞等[12]基于COI條形碼對(duì)海馬及其混偽品21個(gè)物種211份樣品進(jìn)行了種間種內(nèi)序列分析、DNA Barcoding gap檢測(cè)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，研究結(jié)果表明，各不同來源海馬正品與混偽品均能明顯區(qū)分開。嚴(yán)華等[13]采用優(yōu)化的DNA提取方法對(duì)阿膠原材料及其混偽品進(jìn)行了DNA條形碼鑒定，結(jié)果表明，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可行。

4.3 海龍藥材市場(chǎng)考察及DNA條形碼鑒定的意義

本研究在樣品采集過程中，研究人員親自現(xiàn)場(chǎng)考察，在走訪過程中發(fā)現(xiàn)，在安徽亳州藥市、廣西玉林藥市、廣州清平藥市上銷售的海龍藥材，主要以刁海龍(四角龍，商家習(xí)稱，下同)、擬海龍(三角龍)、尖海龍(海針)、寶珈海龍(六角龍)、粗吻海龍(小海龍)、貢氏柄領(lǐng)海龍(大肚海龍)等種類為主，混偽品貢氏柄領(lǐng)海龍售價(jià)高于正品及其余混偽品，銷量最好的海龍是尖海龍、寶珈海龍、粗吻海龍；同時(shí)，在收集粗吻海龍樣品過程中，還發(fā)現(xiàn)粗吻海龍中混有少量海蠋魚進(jìn)行銷售。通過對(duì)海龍藥材產(chǎn)地的文獻(xiàn)進(jìn)行整理總結(jié)[14-16]，研究人員對(duì)海龍產(chǎn)地進(jìn)行了實(shí)地考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在山東省青島市碼頭、海南省?？谑写a頭和文昌市環(huán)球碼頭等地，海龍藥材產(chǎn)量相對(duì)較少，種類以粗吻海龍為主。藥材市場(chǎng)中海龍藥材多采用庫存式銷售，其貨源多以進(jìn)口為主，隨著海龍價(jià)格的持續(xù)走高，也刺激了亞洲、非洲等地走私海龍的積極性，其來源多為亞洲沿海國(guó)家菲律賓、馬來西亞和非洲沿海國(guó)家索馬里、坦桑尼亞等地，這些非法的海龍藥材來源，銷售價(jià)格遠(yuǎn)低于刁海龍，對(duì)藥材市場(chǎng)海龍行情沖擊較大。

本研究基于DNA條形碼鑒定技術(shù)，對(duì)海龍及其市售樣品DNA條形碼鑒定研究，證實(shí)了中藥材DNA條形碼鑒定技術(shù)在海龍及其混偽品鑒定中的可行性，為海龍鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化提供了新的思路，也為名貴珍稀動(dòng)物類中藥市場(chǎng)的規(guī)范化提供可靠的市場(chǎng)管理和監(jiān)控手段。