張 龍，曲克明，張 鵬，汪 魯，李衛(wèi)東，朱建新

(1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，天津 300000)

近年來(lái)，循環(huán)水養(yǎng)殖憑借其養(yǎng)殖密度高、養(yǎng)殖水體污染物質(zhì)量濃度可控、養(yǎng)殖廢水可循環(huán)利用以及環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，受到廣泛關(guān)注[1-2]；循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)還有利于養(yǎng)殖水體中廢物管理和營(yíng)養(yǎng)物遷移轉(zhuǎn)化，可控制養(yǎng)殖生物的疾病發(fā)生[3-5]。然而，與網(wǎng)箱養(yǎng)殖和流水養(yǎng)殖模式相比，在生產(chǎn)中循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的應(yīng)用仍然是較少的，這主要與其較高的投資和運(yùn)行成本有關(guān)[6]。這就要求養(yǎng)殖生產(chǎn)者選擇經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚(yú)種進(jìn)行高密度養(yǎng)殖，提高魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益，從而彌補(bǔ)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的投資運(yùn)行成本，但是較高的養(yǎng)殖密度很可能抑制養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)性能，增加死亡率。因此，在循環(huán)水養(yǎng)殖中選擇合適的放養(yǎng)密度十分重要。養(yǎng)殖密度一直被視為影響魚(yú)類(lèi)健康和產(chǎn)量的重要因素，養(yǎng)殖密度不僅會(huì)改變養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)，而且可以被視作一種應(yīng)激源，對(duì)魚(yú)類(lèi)生理生化指標(biāo)產(chǎn)生重要影響[7]。就生理角度而言，魚(yú)類(lèi)較好的生長(zhǎng)性能可以通過(guò)一些生理生化指標(biāo)表現(xiàn)出來(lái)，如血液血漿的生化指數(shù)。當(dāng)魚(yú)體較健康和生存條件較為適宜時(shí)，魚(yú)體血漿皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度通常是較低的，乳酸和葡萄糖水平處在正常范圍[8]。據(jù)劉寶良等[9]報(bào)道，在較高養(yǎng)殖密度條件下，大菱鲆肝臟抗氧化酶活性降低，而丙二醛水平增加。因此，檢測(cè)密度脅迫條件下魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化狀態(tài)的變化對(duì)改善魚(yú)類(lèi)健康具有至關(guān)重要的意義[10]。

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)憑借其較高的營(yíng)養(yǎng)和商業(yè)價(jià)值，成為日本和中國(guó)較為普遍的養(yǎng)殖品種。一些研究已證明循環(huán)水養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的可行性[11-12]，目前有關(guān)循環(huán)水養(yǎng)殖條件下密度脅迫對(duì)紅鰭東方鲀應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化狀態(tài)影響的研究較少。因此，本文研究養(yǎng)殖密度在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)對(duì)紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)性能、應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化狀態(tài)以及養(yǎng)殖水體水質(zhì)影響，以期為提高紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖產(chǎn)量、改善其生長(zhǎng)環(huán)境提供理論支撐。此外，本研究還通過(guò)硝酸鹽氮急性處理試驗(yàn)，探究不同硝酸鹽氮質(zhì)量濃度(1.0、 25.0、100.0 和150.0 mg/L)對(duì)紅鰭東方鲀應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化狀態(tài)的影響，以確定循環(huán)水養(yǎng)殖過(guò)程中水體硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)施和養(yǎng)殖生物

循環(huán)水養(yǎng)殖試驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)計(jì)如圖1所示，主要由養(yǎng)殖池(9個(gè)，養(yǎng)殖水體30 m3/個(gè))和水處理設(shè)備組成。水處理設(shè)備包括弧形篩、循環(huán)水泵、蛋白分離器、曝氣池、紫外消毒設(shè)備、生物濾池、液氧和羅茨鼓風(fēng)機(jī)等。生物濾池為浸沒(méi)式，可以容納水體126 m3，以聚丙烯材質(zhì)的彈性刷狀生物填料為生物膜載體。養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始之前，生物濾池生物膜已經(jīng)培養(yǎng)完成。該養(yǎng)殖系統(tǒng)在之前的研究中已經(jīng)被成功應(yīng)用于紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖[13]。本試驗(yàn)所用的紅鰭東方鲀(300 g/尾)和試驗(yàn)設(shè)施均由天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。

圖1 紅鰭東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)工藝流程圖

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將紅鰭東方魨(規(guī)格300 g，共14 700尾)隨機(jī)分為3個(gè)密度組：12.5 kg /m3、16.5 kg /m3和20.0 kg /m3，分別標(biāo)記為L(zhǎng)組、M組和H組。各個(gè)密度組處理3個(gè)重復(fù)。在試驗(yàn)期間，每天投喂商品飼料3次(8:00，16:00和 22:00)，各個(gè)密度處理組日投喂量約占魚(yú)體總質(zhì)量的3.0%，根據(jù)紅鰭東方鲀攝食和體質(zhì)量情況進(jìn)行適時(shí)適量調(diào)整，本試驗(yàn)共進(jìn)行50 d。

在試驗(yàn)過(guò)程中測(cè)定一些重要的水質(zhì)指標(biāo)、魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)和抗氧化能力指標(biāo)，以及魚(yú)體生長(zhǎng)性能。水質(zhì)指標(biāo)包括水溫、pH、溶氧、鹽度、氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽質(zhì)量濃度，每10 d測(cè)定1次。魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)包括魚(yú)體血漿葡萄糖(GLU)、乳酸(LAC)、膽固醇(CHO)和皮質(zhì)醇(COR)質(zhì)量濃度；抗氧化能力指標(biāo)包括魚(yú)體肝臟總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)活性、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量。上述指標(biāo)在試驗(yàn)開(kāi)始20 d、30 d、40 d和50 d在各養(yǎng)殖池隨機(jī)抽取10尾紅鰭東方鲀測(cè)定；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在各個(gè)養(yǎng)殖池內(nèi)隨機(jī)抽取30尾鲀對(duì)其生物學(xué)體長(zhǎng)和體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，統(tǒng)計(jì)各個(gè)養(yǎng)殖池內(nèi)魚(yú)體數(shù)量，以計(jì)算養(yǎng)殖紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)率、存活率以及飼料轉(zhuǎn)化率。

通過(guò)硝酸鹽氮急性處理試驗(yàn)，探究不同硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)紅鰭東方鲀應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化的影響。在試驗(yàn)過(guò)程中，利用硝酸鈉和天然海水配置不同質(zhì)量濃度的硝酸鹽氮，其質(zhì)量濃度分別被控制在(1.0±0.3)、 (25.0±1.4)、(100.0±2.6)和(150.0 ± 3.3 )mg/L。試驗(yàn)將平均規(guī)格為300 g的20條紅鰭東方鲀放入180 L含不同質(zhì)量濃度硝酸鹽氮的養(yǎng)殖槽中48 h進(jìn)行急性毒理試驗(yàn)，水體pH為7.7，溫度22 ℃。試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)養(yǎng)殖池內(nèi)隨機(jī)取出5條魚(yú)進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)和抗氧化能力指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 取樣

在試驗(yàn)開(kāi)始20 d、30 d、40 d和50 d，從養(yǎng)殖池內(nèi)隨機(jī)抽取紅鰭東方鲀進(jìn)行血漿和肝臟取樣操作，但在取樣之前需要禁食24 h。紅鰭東方鲀的血液通過(guò)注射器從魚(yú)體尾靜脈抽取，加入抗凝劑，經(jīng)3 000 r/ min的離心處理后獲得血漿，將處理好的血漿儲(chǔ)存在液氮中以備用；肝臟通過(guò)解剖獲得，選取部分儲(chǔ)存在液氮中待用。

1.4 分析方法

1.4.1 水質(zhì)分析

1.4.2 生長(zhǎng)性能參數(shù)

在試驗(yàn)結(jié)束后，分別使用游標(biāo)卡尺、電子天平和電子秤測(cè)量各養(yǎng)殖池內(nèi)紅鰭東方鲀的生物學(xué)體長(zhǎng)、體質(zhì)量，并分別計(jì)算其特定增長(zhǎng)率、存活率以及飼料轉(zhuǎn)化率，公式如下：

TSGR= 100%×(lnW1- lnW0)/t

(1)

CSR= 100%×(S1/S0)

(2)

ZFCR= 100%×(Wf/Wi)

(3)

式中，TSGR—特定增長(zhǎng)率，%/d ；CSR—存活率；ZFCR—飼料轉(zhuǎn)化率；W1—魚(yú)體終體質(zhì)量， g；W0—魚(yú)體初始體質(zhì)量， g ；t—試驗(yàn)天數(shù)， d；S1—養(yǎng)殖開(kāi)始魚(yú)體數(shù)量，尾；S0—養(yǎng)殖末期魚(yú)體數(shù)量，尾；Wf—飼料利用干重，kg；Wi—魚(yú)類(lèi)增加總質(zhì)量，kg。

1.4.3 應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)測(cè)試

取紅鰭東方鲀的血漿樣品加入9倍體積冰冷的生理鹽水(0.9%)，制成10%的血漿稀釋樣品，分裝到2 mL的離心管，進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)測(cè)定。血漿樣品的GLU、 LAC、CHO和COR質(zhì)量濃度均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟參考試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4.4 抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)測(cè)定

取紅鰭東方鲀肝臟樣品，剪碎，加入9倍體積冰冷的生理鹽水(0.9%)，制成10%的勻漿，在4 ℃條件下，3 500 r/min離心15 min，取出上清液，分裝到2 mL的離心管，進(jìn)行抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定。肝臟樣品的T-AOC、SOD、GSH-px、GSH和MDA含量均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟參考試劑說(shuō)明書(shū)。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、差異顯著性檢驗(yàn)分析，用t檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著，P<0.01時(shí)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同養(yǎng)殖密度對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

表1 紅鰭東方鲀?cè)诓煌B(yǎng)殖密度下養(yǎng)殖水體水質(zhì)理化參數(shù)

圖2 不同養(yǎng)殖密度下水體中硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化

3.2 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀生長(zhǎng)性能的影響

不同養(yǎng)殖密度紅鰭東方鲀?cè)谘h(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)參數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，不同養(yǎng)殖密度鲀從初體質(zhì)量300.00 g分別生長(zhǎng)至585.50、576.40和542.30 g，H組與L組、M組的終體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率、餌料轉(zhuǎn)化率之間存在顯著性差異(P<0.05)，且 H組鲀終體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率、餌料轉(zhuǎn)化率高于L組、M組，但各密度組鲀的存活率不存在顯著性差異(P>0.05)。

表2 不同養(yǎng)殖密度對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性能的影響

注：同行上標(biāo)不同字母表示差異顯著

3.3 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀血漿理化指標(biāo)的影響

在試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖密度對(duì)紅鰭東方鲀的血液血漿理化指標(biāo)的改變具有重要影響(圖3)。在試驗(yàn)第40天和50天，H組鲀血漿皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著高于M組和L組(P<0.05)；在試驗(yàn)第50天，H組鲀血漿葡萄糖質(zhì)量濃度顯著低于M組和L組(P<0.05)，而H組鲀血漿乳酸濃度顯著高于L組(P<0.05)，但與M組鲀血漿乳酸質(zhì)量濃度則無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著，下同

3.4 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀肝臟抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

在紅鰭東方鲀養(yǎng)殖末期，養(yǎng)殖密度對(duì)鲀抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化具有重要影響(圖4)。其中，H組鲀肝臟總抗氧化能力顯著低于L組和M組(P<0.05)，但H組鲀肝臟SOD和GSH-px活性顯著低于L組(P<0.05)，這也許表明H組鲀肝臟的抗氧化能力較低。同時(shí)，H組鲀肝臟MDA含量顯著高于L組和M組(P<0.05)。

圖4 不同養(yǎng)殖密度對(duì)紅鰭東方鲀抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

3.5 不同質(zhì)量濃度對(duì)鲀血漿理化指標(biāo)的影響

圖5 不同硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)紅鰭東方鲀血漿理化指標(biāo)的影響

3.6 不同質(zhì)量濃度對(duì)鲀肝臟抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

4 討論

4.1 養(yǎng)殖密度對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體水質(zhì)變化

圖6 不同硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)紅鰭東方鲀抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

4.2 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀生長(zhǎng)性能的影響

4.3 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀應(yīng)激反應(yīng)的影響

魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)一般是由養(yǎng)殖水環(huán)境改變、人類(lèi)活動(dòng)、魚(yú)類(lèi)運(yùn)輸和發(fā)病以及養(yǎng)殖密度增加等因素引起的。其中，較高養(yǎng)殖密度通常被視為魚(yú)類(lèi)集約化養(yǎng)殖過(guò)程中的一種慢性應(yīng)激源，對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)體的生理生化指標(biāo)產(chǎn)生重要影響。魚(yú)類(lèi)血液皮質(zhì)醇和葡萄糖含量是反映魚(yú)類(lèi)抗應(yīng)激能力的重要檢測(cè)指標(biāo)。當(dāng)魚(yú)類(lèi)受到應(yīng)激壓力時(shí)，魚(yú)類(lèi)的下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI)被激活，引起頭腎細(xì)胞中皮質(zhì)醇激素的合成與釋放。魚(yú)類(lèi)交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)也會(huì)受到刺激，引起腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞釋放兒茶酚胺。兒茶酚胺可以促進(jìn)機(jī)體肝臟、骨骼肌和心肌內(nèi)糖原的分解，產(chǎn)生大量葡萄糖供機(jī)體短時(shí)間供能。在本試驗(yàn)中，紅鰭東方鲀?cè)诟呙芏乳L(zhǎng)期脅迫條件下血漿皮質(zhì)醇分泌量增加，促使葡萄糖消耗量增加，這就導(dǎo)致養(yǎng)殖后期高密度試驗(yàn)組鲀血漿葡萄糖質(zhì)量濃度下降，這與Braun等[17]和Fotedar[20]的研究結(jié)果相吻合。本試驗(yàn)中密度脅迫所消耗的葡萄糖絕大部分通過(guò)厭氧糖酵解生成乳酸，促使鲀血漿乳酸水平升高，這與Fotedar[20]研究結(jié)果相一致，而紅鰭東方鲀血漿理化指標(biāo)改變很可能是由高密度條件下魚(yú)類(lèi)的空間擁擠效應(yīng)所引起的。為使魚(yú)類(lèi)適應(yīng)擁擠效應(yīng)所帶來(lái)的應(yīng)激壓力和恢復(fù)正常的生理狀態(tài)，魚(yú)類(lèi)需要消耗大量能量，糖異生能力增強(qiáng)，這也許對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。因此，在紅鰭東方鲀集約化養(yǎng)殖中必須選擇適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖密度，以降低鲀?cè)诟呙芏让{迫條件下應(yīng)激壓力發(fā)生的概率。

4.4 不同養(yǎng)殖密度對(duì)鲀抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是機(jī)體新陳代謝活動(dòng)的重要組成部分。在正常情況下，需氧動(dòng)物的基本代謝會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基和活性氧分子(ROS)，以維持生物機(jī)體生理生化活動(dòng)和免疫功能。然而，當(dāng)生物機(jī)體內(nèi)氧自由基和ROS過(guò)多時(shí)，它們就會(huì)攻擊生物的抗氧化系統(tǒng)，造成機(jī)體抗氧化能力減弱、抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量降低。T-AOC、SOD、GSH-px、GSH和MDA等是衡量生物機(jī)體免疫機(jī)能的重要指標(biāo)。其中，SOD是降解活性氧自由基的第一道防線，可以將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，然后由過(guò)氧化氫酶將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣；GSH-px可以清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物；GSH為一類(lèi)小分子抗氧化劑，可以清除氧自由基和解毒親電體，維持巰基-二硫鍵的平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本試驗(yàn)中，當(dāng)紅鰭東方鲀養(yǎng)殖密度在20.0 kg/m3時(shí)，肝臟T-AOC、SOD和GSH-px水平明顯降低，這表明鲀?cè)诟呙芏让{迫條件下產(chǎn)生大量氧自由基和活性氧分子，需要消耗大量抗氧化酶和抗氧化活性物質(zhì)，導(dǎo)致其總抗氧化能力降低，這與Braun 等[17],Trenzado等[24]的研究結(jié)果相一致。紅鰭東方鲀?cè)诟呙芏葪l件下持續(xù)產(chǎn)生大量的自由基，而過(guò)多的自由基會(huì)攻擊生物膜，生成脂質(zhì)過(guò)氧化物，并最終分解成MDA。在本試驗(yàn)中，在較高密度條件下紅鰭東方鲀肝臟MDA含量顯著升高，這與Sahin 等[25]、王博文等[26]研究結(jié)果相吻合。紅鰭東方鲀的脂質(zhì)過(guò)氧化很可能是由密度脅迫引起的。但在以前的非洲鯰、大菱鲆密度脅迫試驗(yàn)中，魚(yú)體在高密度條件下未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化的現(xiàn)象，這可能與試驗(yàn)條件和養(yǎng)殖生物不同有關(guān)[10,12]。

4.5 不同質(zhì)量濃度對(duì)鲀應(yīng)激反應(yīng)的影響

4.6 不同質(zhì)量濃度對(duì)鲀抗氧化能力和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

5 結(jié)論

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