劉 鋒，梅 俊，謝 晶

(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海海洋大學食品學院，上海 201306)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)盛產(chǎn)于大西洋東側(cè)沿岸，是名貴的低溫經(jīng)濟魚類[1]。大菱鲆因其蛋白含量高、營養(yǎng)豐富、味道鮮美等特點為消費者喜愛。自1992年從國外引進大菱鲆養(yǎng)殖以來，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，大菱鲆已成為中國北方沿海養(yǎng)殖的主要品種之一[2]。隨著大菱鲆產(chǎn)業(yè)逐漸復蘇，如何有效保持其在貯藏過程中的品質(zhì)特性，延長貨架期，擴大銷售范圍、滿足商超生鮮商品的供應(yīng)需求，正日益引起人們的高度關(guān)注[3]。貯藏溫度是決定水產(chǎn)品貨架期的關(guān)鍵因素，不同溫度下水產(chǎn)品的品質(zhì)和貨架期差異顯著[4]。目前，關(guān)于水產(chǎn)品貨架期預(yù)測模型的研究主要為零級和一級動力學模型。雷志方等[5]建立了不同溫度條件下的金槍魚貨架期預(yù)測模型，動力學分析表明零級動力學模型比一級動力學模型更符合金槍魚各項指標的變化。姜元欣等[6]通過對不同凍藏溫度下羅非魚品質(zhì)變化的研究，確定揮發(fā)性鹽基總氮(TVB-N)為敏感指標，并建立了恒定冷鏈溫度下凍藏羅非魚的貨架期模型。Li等[7]基于菌落總數(shù)、TVB-N以及硫代巴比妥酸值(TBA)，利用Arrhenius方程建立了不同貯藏溫度下真空包裝羅非魚的動力學預(yù)測模型。崔正翠等[8]基于希瓦氏菌的生長情況利用修正的Gompertz方程建立了0 ℃～10 ℃下貯藏大菱鲆特定腐敗菌希瓦氏菌的生長動力學和貨架期預(yù)測模型。

本研究以感官、揮發(fā)性鹽基總氮(TVB-N)、菌落總數(shù)、硫代巴比妥酸值、電導率、肌肉的微觀結(jié)構(gòu)變化、水分遷移狀況為指標，研究大菱鲆貯藏在-3 ℃、0 ℃、4 ℃、10 ℃和15 ℃條件下的品質(zhì)變化，應(yīng)用動力學模型和Arrhenius方程建立揮發(fā)性鹽基總氮(TVB-N)及菌落總數(shù)隨貯藏溫度和時間變化的貨架期預(yù)測模型，確定貨架期與不同溫度之間的相關(guān)性，為大菱鲆保鮮技術(shù)的優(yōu)化以及貨架期的實時監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮養(yǎng)殖大菱鲆購于上海市浦東新區(qū)蘆潮港水產(chǎn)批發(fā)市場，規(guī)格基本一致(600±50)g，活魚裝入加水的充氧袋中，立即運回實驗室處理。平板計數(shù)瓊脂(PCA)、三氯乙酸、MgO、甲基紅、溴甲酚綠、硫代巴比妥酸、無水乙醇、二甲苯、福爾馬林、蘇木精、伊紅，購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-100CB恒溫恒濕箱(上海一恒科學儀器有限公司)；低場核磁共振成像分析儀(上海紐邁電子科技有限公司)；FOSS凱氏定氮儀(瑞典FOSS公司)；WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；高溫高壓滅菌鍋(HVE-50，日本Hi-rayama制造有限公司)；Nikon-E200 光學顯微鏡(日本Nikon公司)；RM2235 冷凍切片機(德國Leica公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮的大菱鲆用蒸餾水沖洗，去腮和內(nèi)臟，待水瀝干后以整條魚密封在聚乙烯保鮮袋中，分別于-3 ℃、0 ℃、4 ℃、10 ℃、15 ℃條件下貯藏，15 ℃每12 h取樣，10 ℃每1 d取樣，4 ℃每2 d取樣，0 ℃每3 d取樣，-3 ℃每4 d取樣，感官評分達到腐敗時停止取樣，測定并記錄不同指標數(shù)據(jù)的變化情況。

1.3.2 感官評定

參考GB 2733—2015 鮮、凍動物性水產(chǎn)品[9]及張彩麗等[10]對海水魚感官評定方法，稍作修改。選取6個專業(yè)人員組成感官評定小組，從色澤、氣味、組織形態(tài)和彈性4個方面對大菱鲆品質(zhì)進行評分，總分值16～20為新鮮，9～15為品質(zhì)良好，8分以下為腐敗變質(zhì)。具體評分標準見表1。

1.3.3 TVB-N、電導率和TBA的測定

TVB-N測定參照凡玉杰等[11]的方法；電導率測定參考胡玥等[12]的方法；TBA參考馬超鋒等[13]的方法測定。

表1 大菱鲆感官特性檢驗評分標準

1.3.4 菌落總數(shù)和持水力 (WHC)的測定

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016[14]測定。持水力參照HAN[15]等的方法測定。

1.3.5 水分遷移狀況的研究

參考王尊等[16]的方法，略作修改。將切好的魚塊(2 cm×2 cm×1 cm)用保鮮膜包裹，放入測定管中，采用核磁共振成像分析儀測定魚樣T2馳豫時間，設(shè)置T2測量參數(shù)：采樣頻率(SW)=100 kHz，模擬增益(RG1)=20 dB，硬脈沖90°脈寬(P1)=18 μs，數(shù)字增益(DRG1)=3 dB，采樣點數(shù)(TD)=200 020，重復采樣等待時間(TW)=5 000 ms，累加次數(shù)(NS)=8，硬脈沖180°脈寬(P2)=37 μs，回波時間(TE)=0.4 ms，回波個數(shù)(NECH)=5 000。根據(jù)CPMG指數(shù)衰減曲線圖，用分析軟件進行迭代反演得到橫向弛豫時間T2圖譜。將同樣的魚塊再次放入測定管中，用核磁共振成像儀進行成像，得到質(zhì)子密度圖后對圖像統(tǒng)一映射和偽彩。

1.3.6 背部肌肉微觀組織觀察

參照李婷婷等[17]的方法，將大菱鲆的背部肌肉切成5 mm×5 mm×5 mm的小塊，置于5%的福爾馬林溶液中固定24 h，乙醇梯度脫水后，經(jīng)二甲苯透明處理、石蠟包埋，制成1 cm3的石蠟塊，然后用Leica切片機切成10 μm厚的薄片，HE常規(guī)染色后在光學顯微鏡下(10×10倍)觀察切片組織。大菱鲆屠宰后取新鮮魚樣，不同貯藏溫度的樣品分別在貯藏末期取樣(15 ℃ 3 d，10 ℃ 5 d，4 ℃ 11 d，0 ℃ 15 d，-3 ℃ 20 d)。

1.3.7 大菱鲆貨架期預(yù)測模型的建立

(1)動力學模型。在評價水產(chǎn)品的品質(zhì)變化時，通常采用一級反應(yīng)動力學方程進行模擬預(yù)測。

B=B0ekt

(1)

式中：B0為測定品質(zhì)指標的初始值；k為反應(yīng)速率常數(shù)；t為貯藏時間，d；B為貯藏第t天時品質(zhì)指標的測定值。

(2) Arrhenius方程。Arrhenius方程反應(yīng)溫度T與反應(yīng)速率常數(shù)k之間的關(guān)系，方程如下：

(2)

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；A0為指前因子；Ea為活化能，J/mol；R為氣體常數(shù)，8.314 510 J/(mol·K)；T為絕對溫度，K。 將270 K、273 K、277 K、283 K和288 K溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)k結(jié)合Arrhenius方程進行擬合得到活化能Ea和指前因子A0。

(3)貨架期模型的建立。結(jié)合動力學模型和Arrhenius方程得到大菱鲆的貨架期模型：

(3)

式中：tSL為貨架期，d。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上每個指標做3次平行實驗，利用Excel繪制圖表，采用Origin8.5軟件繪制折線圖，并使用SPSS22.0對試驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析和顯著性分析，P<0.01表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，各組大菱鲆的感官品質(zhì)均下降。這是由于大菱鲆在貯藏過程中酶活性的化學反應(yīng)以及微生物大量繁殖的共同作用所致，15 ℃和10 ℃的樣品感官下降迅速，分別在第3天和第6天達到感官不可接受程度；4 ℃和0 ℃在貯藏前期差異不顯著(P>0.01)，貯藏10 d后感官下降速率增大，4 ℃和0 ℃貯藏分別于第13天和第16天超出可接受范圍；-3 ℃貯藏的大菱鲆時間最長，可達24 d，這是由于微凍環(huán)境抑制了微生物的繁殖以及酶活性的化學反應(yīng)，大幅延長大菱鲆的貨架期，但是在到達貨架期終點時，0 ℃樣品的感官品質(zhì)要略好于-3 ℃。

圖1 不同貯藏溫度大菱鲆感官評分的變化

2.2 TVB-N的變化

揮發(fā)性鹽基總氮是指水產(chǎn)品在貯藏期間受到微生物和酶的作用，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生氮以及胺類等堿性揮發(fā)性物質(zhì)，是國際上衡量水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的重要指標[18]。根據(jù)GB/T18108—2008《鮮海水魚》[19]規(guī)定：海水魚的TVB-N≤15 mg/100g，屬于一級品；TVB-N≤20 mg/100g，屬于二級品；TVB-N≤30 mg/100g為三級品。分析TVB-N值可以得出15 ℃、10 ℃、4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏大菱鲆的貨架期分別為2.5 d、5 d、12 d、15 d和24 d，可見低溫可以抑制酶活性和微生物的繁殖，降低蛋白質(zhì)的降解速度(圖2)。

圖2 不同貯藏溫度下大菱鲆TVB-N的變化

2.3 電導率的變化

電導率能夠反映物體的導電能力，是一種快速檢測水產(chǎn)品新鮮度的方法[20]。由圖3可知，新鮮大菱鲆的電導率為1 546 us/cm，貯藏在不同溫度下的大菱鲆電導率均不斷上升，這是因為在貯藏過程中，魚體內(nèi)的脂肪、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在外源性微生物蛋白酶的作用下分解成小分子物質(zhì)，并以大量離子的形式存在，從而使溶液的導電能力增強。15 ℃和10 ℃貯藏的樣品相比于4 ℃、0 ℃以及-3 ℃，電導率上升的速度要快得多。主要是因為溫度升高，引起電解質(zhì)的電離度增大，離子遷移速度增大，電導率也隨之增加。隨著貯藏時間的延長，大菱鲆魚肉分解出來的產(chǎn)物越來越多，溶液導電能力越強，電導率不斷增加，新鮮度也越差。實驗表明，大菱鲆的電導率與貯藏溫度緊密相關(guān)，降低溫度可減緩其品質(zhì)裂變進程，保證新鮮度。大菱鲆在15 ℃、10 ℃、4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏溫度下TVB-N與電導率的相關(guān)系數(shù)分別為0.968、0.978、0.957、0.912、0.951，呈顯著相關(guān)(P<0.01)，這與宋麗榮[21]等人對羅非魚貯藏期間TVB-N與電導率相關(guān)性研究得出的結(jié)果相一致。

圖3 不同貯藏溫度下大菱鲆電導率的變化

2.4 菌落總數(shù)的測定

微生物是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的重要因素之一，微生物的生長繁殖使魚體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)降解，產(chǎn)生胺類、硫化氫等物質(zhì)，發(fā)出具有腐敗特征的臭味[22]，因此，檢測大菱鲆貯藏過程中的微生物動態(tài)變化能夠很好地反映其品質(zhì)特性。

大菱鲆在15 ℃、10 ℃、4 ℃、0 ℃和-3 ℃的微生物變化如圖4所示，該圖表明不同貯藏溫度下大菱鲆菌落總數(shù)的變化差異顯著(P<0.01)。大菱鲆菌落總數(shù)的初始值為3.85 log(CFU/g)，隨著貯藏時間的延長，各組菌落總數(shù)值不斷上升，15 ℃和10 ℃微生物生長直接進入對數(shù)期，分別在第3 天和第6 天達到7.12 log(CFU/g)和7.06 log(CFU/g)，超過了水產(chǎn)品微生物數(shù)量的最高可接受限度(7 log CFU/g)[23]，4 ℃和0 ℃貯藏的微生物貯藏前期生長緩慢，這是因為微生物的新陳代謝需要酶的催化，低溫抑制了酶的催化速率，分別在第12 天和第15 天接近可接受閾值，而-3 ℃的菌落數(shù)在初始階段有所下降，可能是因為魚體自身攜帶的一些細菌因不適應(yīng)微凍環(huán)境受到抑制，直到貯藏末期仍未超過可接受閾值，結(jié)果表明-3 ℃可大大延長大菱鲆的貨架期。

圖4 不同貯藏溫度下菌落總數(shù)的變化

2.5 持水力(WHC)的測定

由圖5可知，5組大菱鲆的持水性不斷下降，15 ℃和10 ℃環(huán)境下貯藏的持水力下降速度要遠大于4 ℃、0 ℃、-3 ℃組的樣品，可能是因為溫度的升高導致蛋白質(zhì)降解越來越嚴重，肌原纖維蛋白變性程度增大，結(jié)合水的能力下降，并且在貯藏前期，5組樣品的持水性差異不明顯，后期越來越顯著(P<0.01)，原因可能是貯藏時間的增加會加劇蛋白質(zhì)的變性[24]。觀察圖4和圖5發(fā)現(xiàn)，二者在表征大菱鲆鮮度上呈現(xiàn)負相關(guān)(P<0.01)，15 ℃、10 ℃、4 ℃、0 ℃和-3 ℃貯藏溫度下的菌落總數(shù)與持水力的相關(guān)系數(shù)分別為-0.906、-0.955、-0.983、-0.992和-0.965。

圖5 不同貯藏溫度下大菱鲆持水力的變化

2.6 TBA的變化

大菱鲆在貯藏過程中脂肪氧化產(chǎn)生丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物，通過測定該物質(zhì)在532 nm處的吸光度判斷大菱鲆的氧化程度[25]。脂肪氧化通常發(fā)生在貯藏的初始階段。由圖6可以看出，大菱鲆的TBA值在貯藏期間總體呈先上升后下降的趨勢，主要是因為貯藏后期丙二醛與蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)被分解，引起質(zhì)量濃度降低。TBA的初始值為0.045 mg/kg，不同溫度下貯藏末期TBA值均出現(xiàn)上升，表明大菱鲆在貯藏期間發(fā)生了脂質(zhì)氧化，品質(zhì)出現(xiàn)劣變。

2.7 魚肉水分變化的 LF-NMR研究

魚肉中的水分主要以不易流動水的形式存在[26]，其在貯藏加工與銷售過程中起重要作用，因此，本試驗著重考察魚肉在貯藏期間不易流動水橫向弛豫時間T22和馳豫面積P22的變化(表2)。隨著貯藏時間的延長，5種不同貯藏溫度下魚肉中不易流動水均呈下降趨勢，總體來看，-3 ℃魚片的T22下降速率相比于其他溫度較為緩慢。T22值不斷下降表明魚肉在貯藏過程中水分子受到的約束力增大，水分活度減小，疏水性降低，可能是因為貯藏后期蛋白質(zhì)變性程度變大，致使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水。在貯藏末期樣品已經(jīng)變質(zhì)，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，水分遷移速率顯著降低(P<0.01)。

圖6 不同貯藏溫度下大菱鲆TBA的變化

而所有組的馳豫面積P22在貯藏前期均呈上升趨勢，可能是因為魚體死后機體缺氧、細胞膜通透性增大、肌絲脹大、吸水能力增強所致[27]。P22值在貯藏后期下降，是因為長時間的貯藏使魚體表面出現(xiàn)干耗，肌原纖維收縮將細胞內(nèi)的水分擠壓出來，不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水。各溫度在貯藏末期P22含量存在差異，可見溫度和時間都會影響魚肉中不易流動水P22的變化。

表2 大菱鲆在不同貯藏溫度下水分橫向弛豫時間T22和馳豫面積P22的變化

圖7表示大菱鲆在不同貯藏溫度期間的核磁共振(MRI)成像圖。一般而言，MRI圖像中亮度越強，表明該部分的水分含量越高[28]。由圖7可得，在貯藏過程中，不同貯藏溫度下大菱鲆MRI圖像的亮度逐漸降低，貯藏末期亮度基本消失，表明魚樣已發(fā)生腐敗。15 ℃和10 ℃成像亮度的減弱程度大于4 ℃、0 ℃和-3 ℃，表明低溫貯藏可以延緩魚體的腐敗，適宜用于保持魚體原本的鮮度和魚肉的品質(zhì)，抑制魚體死后出現(xiàn)的生物化學變化[29]。

2.8 肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的變化

圖8顯示大菱鲆魚肉在不同貯藏溫度下的橫斷面微觀組織結(jié)構(gòu)。圖8a表明，新鮮大菱鲆魚肉肌纖維結(jié)構(gòu)緊密，輪廓清晰，肌纖維之間有一些微小的間隙；當15 ℃和10 ℃魚樣貯藏至第3 天和第5 天時(圖8b和圖8c)，肌纖維受到擠壓發(fā)生嚴重位移，且肌纖維斷面邊緣出現(xiàn)大量絮狀物，輪廓模糊，肌纖維扭曲變形、斷裂嚴重；當4 ℃和0 ℃貯藏至11 d和15 d后(圖8d和圖8e)，兩組的肌纖維均逐漸變形，不斷發(fā)生斷裂和小片化，肌節(jié)間隙增大，肌纖維結(jié)構(gòu)由緊密變得疏松，這兩組溫度下的魚樣相比于15 ℃和10 ℃，細胞完整性保持較好；當-3 ℃貯藏至第20天時(圖8f)，與新鮮魚樣相比，肌纖維結(jié)構(gòu)依然較完整，輪廓清晰，但肌纖維內(nèi)部出現(xiàn)裂口損傷，肌節(jié)間隙增大，可能是因為微凍條件下細胞內(nèi)部產(chǎn)生許多小冰晶，導致細胞受到機械損傷，肌纖維斷裂。

圖7 不同貯藏溫度下大菱鲆核磁共振成像圖的變化

圖8 不同溫度下大菱鲆肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)變化

2.9 貨架期預(yù)測模型的建立

2.9.1 大菱鲆品質(zhì)動力學分析

根據(jù)公式(1)，利用Origin 8.5分別對大菱鲆的TVB-N值和菌落總數(shù)值進行非線擬合，得到一級動力學模型的反應(yīng)速率常數(shù)k及回歸系數(shù)R2(表3)，R2越大，表明擬合度越高，預(yù)測效果越好。

表3 不同貯藏溫度下大菱鲆品質(zhì)變化的動力學模型參數(shù)

2.9.2 Arrhenius方程中指前因子A0和活化能Ea的計算

根據(jù)式(2)，對k和T作非線性擬合，計算可得大菱鲆TVB-N及菌落總數(shù)變化預(yù)測模型中的指前因子A0和活化能Ea(表4)。

表4 TVB-N和TVC變化預(yù)測模型中的指前因子A0和活化能Ea

將TVB-N及菌落總數(shù)的A0和Ea分別代入到式(3)中可得到對應(yīng)的貨架期預(yù)測模型。

大菱鲆基于TVB-N的貨架期預(yù)測模型：

(4)

大菱鲆基于菌落總數(shù)的貨架期預(yù)測模型：

(5)

式中：BTVB-N、BTVC為大菱鲆貯藏第t天時的TVB-N和菌落總數(shù)的測定值；BTVB-N0、BTVC0為TVB-N和菌落總數(shù)的初始值；tsL為貨架期，d。

2.10 貨架期模型的驗證與評價

為了驗證該動力學預(yù)測模型的準確性，比較283 K溫度下大菱鲆TVB-N及菌落總數(shù)值的實際測量值與模擬預(yù)測值，結(jié)果見表5。

表5 283 K溫度下大菱鲆的貨架期預(yù)測誤差

由表5可知，以TVB-N值建立的貨架期預(yù)測模型，大菱鲆的實測值與貨架期方程預(yù)測值相比，相對誤差在±10%以內(nèi)，而以菌落總數(shù)建立的貨架期預(yù)測模型相對誤差達到12.6%，因此從整體的預(yù)測效果來看，以TVB-N值建立的貨架期預(yù)測模型能夠較為準確地預(yù)測大菱鲆的貨架期。

3 結(jié)論

研究了大菱鲆貯藏在不同溫度下的品質(zhì)變化，選取TVB-N值和菌落總數(shù)構(gòu)建貨架期預(yù)測模型。結(jié)果表明，降低溫度可顯著延緩各指標的變化速率，抑制產(chǎn)品劣變，從而延長大菱鲆的貨架期。大菱鲆在貯藏過程中的TVB-N值和菌落總數(shù)符合一級動力學模型，通過一級動力學模型結(jié)合Arrhenius方程構(gòu)建的貨架期預(yù)測模型具有較高的擬合度，10 ℃指標實測值與模型預(yù)測值相對誤差在10%以內(nèi)，表明該模型可信度高。該模型只需測定產(chǎn)品的TVB-N值就可以得到產(chǎn)品的剩余貨架期，操作快速準確。該模型可預(yù)測-3 ℃～15 ℃下大菱鲆的貨架期，應(yīng)用范圍更廣。因此，該貨架期預(yù)測模型具有較高的實用性，可成為預(yù)測大菱鲆貨架期的一種有效途徑。