陸 偉，王雁冰，張占卿，黃 丹，李秀芬，周新蘭，丁榮蓉，曾 東，馮艷玲

上海市公共衛(wèi)生臨床中心 1.肝膽內(nèi)科； 2.病理科，上海 201508

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染依次經(jīng)歷乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陽性和陰性兩個階段；無論HBeAg陽性或陰性階段，均先后經(jīng)歷肝炎活動期和非活動期[1-4]。迄今為止，大多數(shù)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)實踐指南將血清HBV DNA載量和血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶水平或肝臟組織學評價作為識別活動期和決定實施抗病毒治療的主要參考指標[1-4]。最近有研究顯示，血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎核心抗體(hepatitis B core antibody，anti-HBc)水平也可作為鑒別非活動期與活動期的重要指標[5-9]。

血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)是HBeAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)和乙型肝炎核心相關(guān)蛋白p22cr的變性混合物[10-11]，其中，p22cr主要存在于HBV DNA陰性和HBcAg缺乏的Dane樣顆粒(Dane-like particles)中[12]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，血清HBcrAg水平在慢性HBV感染自然史不同分期之間也存在差異[13-14]。本文旨在通過與其他血清病毒學指標比較，進一步探討血清HBcrAg在慢性HBV感染自然史不同分期之間的差異及其對HBeAg陽性和陰性慢性HBV感染患者活動期的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2015年6月上海市公共衛(wèi)生臨床中心經(jīng)歷肝臟活檢的初治慢性HBV感染患者492例。其中，HBeAg陽性292例，男189例，女103例，年齡(34.29 ±10.49)歲(14～72歲)；HBeAg陰性200例，男124例，女76例，年齡(42.80±11.56)歲(17～72歲)；HBeAg陽性與陰性患者性別比例的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.272，P=0.6017)，年齡差異有統(tǒng)計學意義(t=8.474，P<0.0001)。參照中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》(2015更新版)[3]，結(jié)合肝臟組織學評價，HBeAg陽性感染患者分別有49例和243例被診斷為非活動期和活動期；HBeAg陰性感染者分別有101例和99例被診斷為非活動期和活動期。合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、遺傳性肝病、血吸蟲性肝病和內(nèi)分泌與代謝疾病、血液系統(tǒng)疾病的患者被排除。本研究得到了上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會的批準，研究過程遵循Helsinki宣言。

1.2 實驗室檢查血清HBcrAg采用化學發(fā)光酶免疫法和Lumipulse G1200全自動化學發(fā)光免疫分析儀(Fujirebio Inc.)及其配套試劑(批號：SAX5031，日本)檢測；檢測范圍1～10 000 kU/ml，如超過檢測上限，血清被稀釋100倍重新檢測。血清HBsAg和HBeAg采用化學發(fā)光微粒子免疫法和Architect I2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀(Abbott Laboratories)及其配套試劑檢測；其中，HBsAg檢測范圍0.05～250 IU/ml，如超過檢測上限，血清被稀釋500倍重新檢測；HBeAg檢測檢測下限為1 s/CO。血清HBV DNA采用Bio-Rad Icycler PCR系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Inc.)檢測，試劑盒購自QIAGEN生物工程(深圳)有限公司；檢測范圍5×102～5×107IU/ml。

1.3 肝臟組織學評價所有患者在接受肝活檢前常規(guī)簽署知情同意書。肝臟活檢采用1 s經(jīng)皮肝穿刺法。標本采集后立即置塑料標本管內(nèi)冰凍送檢。肝臟標本的質(zhì)量評價和肝臟病理學診斷由1名有經(jīng)驗的病理學醫(yī)師獨立完成。肝臟病理學診斷采用Scheuer評分系統(tǒng)[15]，肝臟病理學分級包括G0～G4五級，分期包括S0～S4五期。肝臟HBsAg和HBcAg采用免疫組化法檢測。肝臟HBsAg和HBcAg表達水平分為四級：-(無陽性細胞)、+(陽性細胞<25%)、++(陽性細胞25%～49%)、+++(陽性細胞≥50%)。

1.4 統(tǒng)計學分析采用Medcalc 15.8軟件進行統(tǒng)計分析。HBeAg陽性和陰性患者非活動期與活動期血清病毒學指標之間的差異比較采用兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗，非活動期與活動期肝臟HBsAg和HBcAg不同表達水平構(gòu)成比之間的差異比較采用Pearsonχ2檢驗。血清HBcrAg與血清和肝臟其他病毒學指標之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。血清HBcrAg和其他病毒學指標預測HBeAg陽性和陰性患者活動期的性能評價采用ROC曲線法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 非活動期與活動期血清和肝臟病毒學指標不同比例之間的差異比較HBeAg陽性患者，非活動期和活動期血清HBcrAg高于100倍檢測上限的比例分別為0(0/49)和0.82%(2/243)，HBsAg高于超過稀釋500倍檢測上限的比例分別為12.24%(6/49)和5.76%(14/243)，HBV DNA高于超過檢測上限的比例分別為71.43%(35/49)和37.45%(91/243)；非活動期與活動期血清HBcrAg、HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。非活動期和活動期肝臟HBsAg水平-、+、++、+++的構(gòu)成比分別為0(0/49)、18.37%(9/49)、51.02%(25/49)、30.61%(15/49)和2.06%(5/243)、22.22%(54/243)、34.98%(85/243)、40.74%(99/243)，HBcAg水平-、+、++、+++的構(gòu)成比分別為26.53%(13/49)、36.73%(18/49)、36.73%(18/49)、0(0/49)和62.55%(152/243)、28.40%(69/243)、9.05%(22/243)、0(0/243)；非活動期與活動期肝臟HBsAg不同水平構(gòu)成比之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.1614)，HBcAg不同水平構(gòu)成比之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；其中，非活動期肝臟HBcAg≥+的比例顯著高于活動期(χ2=16.970，P<0.0001)(見表1、圖1)。

HBeAg陰性患者，非活動期和活動期血清HBcrAg低于檢測下限的比例分別為61.39%(62/101)和7.07%(7/99)，HBsAg低于檢測下限的比例分別為0(0/101)和0(0/99)，HBV DNA低于檢測下限的比例分別為51.49%(52/101)和0(0/99)；非活動期與活動期血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0001、P=0.0477、P<0.0001)。非活動期和活動期肝臟HBsAg水平-、+、++、+++的構(gòu)成比分別為12.87%(13/101)、40.59%(41/101)、30.69%(31/101)、15.84%(16/101)和4.04%(4/99)、22.22%(22/99)、45.45%(45/99)、28.28%(28/99)，HBcAg水平-、+、++、+++的構(gòu)成比分別為96.04%(97/101)、2.97 %(3/101)、0.99%(1/101)、0(0/101)和91.92%(91/99)、7.07%(7/99)、1.01%(1/99)、0(0/99)；非活動期與活動期肝臟HBsAg不同水平構(gòu)成比之間的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0005)，HBcAg不同水平構(gòu)成比之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.4031)；其中，非活動期肝臟HbsAg≥+和≥++的比例分別顯著高于和顯著低于活動期(χ2=140.703，P<0.0001和χ2=33.612，P< 0.0001)(見表1、圖1)。

表1 HBeAg陽性和陰性患者非活動期與活動期血清和肝臟病毒學指標之間的差異比較Tab 1 Comparison of virological indexes between active and active serum and liver in patients with positive and negative HBeAg

注：M：中位值：IQR：四分位距。a:兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗； b: Pearsonχ2檢驗。

2.2 HBeAg陽性與陰性階段血清和肝臟病毒學指標之間的差異比較非活動期患者，HBeAg陽性與陰性血清HBsAg、HBcrAg和HBV DNA之間的差異均有統(tǒng)計學意義(Z=9.616，P<0.0001;Z=10.246，P<0.0001和Z=10.178，P<0.0001)；肝臟HBsAg和HBcAg不同水平構(gòu)成比之間的差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=18.331，P=0.0004和χ2=81.884，P<0.0001)；其中，HBeAg陽性肝臟HBsAg≥+和≥++的比例均顯著高于HBeAg陰性(Fisher精確檢驗，P=0.005和χ2=16.685，P<0.0001)，HBeAg陽性肝臟HBcAg≥+和≥++的比例均顯著高于HBeAg陰性(χ2=81.515，P<0.0001和χ2=38.107，P<0.0001)(見表1、圖1)。

活動期患者，HBeAg陽性與陰性血清HBsAg、HBcrAg和HBV DNA之間的差異均有統(tǒng)計學意義(Z=7.915，P<0.0001;Z=12.028，P< 0.0001和Z=9.073，P<0.0001)；肝臟HBsAg和HBcAg不同水平構(gòu)成比之間的差異分別為無統(tǒng)計學意義和有統(tǒng)計學意義(Fisher精確檢驗，P=0.1264；χ2=29.699，P<0.0001)；HBeAg陽性肝臟HbcAg≥+和≥++的比例均顯著高于HBeAg陰性(χ2=29.496，P<0.0001，χ2=29.496，P<0.0001)(見表1、圖1)。

2.3 血清HBcrAg與血清和肝臟其他病毒學指標的相關(guān)性HBeAg陽性患者，非活動期血清HBcrAg與血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與肝臟HBsAg和HBcAg均無顯著相關(guān)性(P>0.05)；活動期血清HBcrAg與血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA均呈顯著正相關(guān)(P<0.0001)，與肝臟HBsAg和HBcAg均呈顯著正相關(guān)(P<0.005，見表2)。

HBeAg陰性患者，非活動期血清HBcrAg與血清HBsAg和HBV DNA分別呈顯著正相關(guān)(P<0.0001)和無顯著相關(guān)性(P=0.1589)，與肝臟HBsAg和HBcAg分別呈顯著正相關(guān)(P<0.0001)和無顯著相關(guān)性(P=0.7569)；活動期血清HBcrAg與血清HBsAg和HBV DNA均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與肝臟HBsAg和HBcAg均無顯著相關(guān)性(P>0.05，見表2)。

注：自然分期(phase)：1代表HBeAg陽性非活動期；2代表HBeAg陽性活動期；3代表HBeAg陰性非活動期；4代表HBeAg陰性活動期。A：HBcrAg；B：HBsAg；C：HBeAg；D：HBV DNA。圖中中間水平線代表中位值，上下兩條水平線代表四分位距。

觀察變量 例數(shù)血清HBsAg血清HBeAg血清HBV DNA肝臟HBsAg肝臟HBcAgHBeAg陽性非活動期 49rs0.4310.4110.291-0.0930.112P值0.00200.00330.04210.52660.4456 活動期 243rs0.6170.7440.5780.2000.390P值<0.0001<0.0001<0.00010.0018<0.0001HBeAg陰性 非活動期 101rs0.433—0.1410.393-0.0312P值<0.0001—0.1589<0.00010.7569 活動期 99rs0.216—0.6510.0500.124P值0.0320— <0.00010.62530.2256

2.4 血清HBcrAg預測HBeAg陽性和陰性患者活動期的性能HBeAg陽性患者，血清HBsAg預測活動期的AUROC最大且顯著大于血清HBcrAg和HBV DNA預測活動期的AUROC(P<0.05，見表3、圖2)。

HBeAg陰性患者，血清HBsAg預測活動期的AUROC最小且顯著小于血清HBcrAg和HBV DNA預測活動期的AUROC(P<0.0001)，血清HBV DNA預測活動期的AUROC最大且顯著大于血清HBcrAg預測活動期的AUROC(見表3、圖2)。

血清HBcrAg、HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測HBeAg陽性患者活動期的最佳截斷值分別為≤5.156 log10 KU/ml、≤4.276 log10 IU/ml、≤3.007 log10 s/CO和≤7.599 log10 IU/ml；血清HBcrAg和HBV DNA預測HBeAg陰性患者活動期的最佳截斷值分別為>1.428 log10 kU/ml、>3.942 log10 IU/ml(見表4)。

表3 血清病毒學指標預測HBeAg陽性和陰性患者活動期的AUROCTab 3 AUROC for predicting the active period of HBeAg-positive and negative patients by serum virologic index

注：AUROC：ROC曲線下面積；SE：標準誤。a：Z=2.072，P=0.0383；b：Z=3.115，P=0.0018；c：Z=7.168，P<0.0001；d：Z=4.128，P<0.0001；e：Z=9.837，P<0.0001。

圖2 血清病毒學指標預測HBeAg陽性和陰性患者活動期的ROC曲線 A：預測HBeAg陽性患者活動期；B：預測HBeAg陰性患者活動期Fig 2 ROC curve of serum virological index predicting active stage of HBeAg positive and negative patients A: predicting active stage of HBeAg positive patients; B: predicting active stage of HBeAg negative patients

測試變量HBeAg陽性Cut-offSen /%Spe /%+LR-LR+PV /%-PV /%AccHBeAg陰性Cut-offSen /%Spe /%+LR-LR+PV /%-PV /%AccHBcrAg (log10 kU/ml)≤5.15666.377.62.950.4493.631.70.61>1.42872.795.114.690.2993.578.00.84HBsAg (log10 IU/ml)≤4.27665.093.910.620.3798.135.10.65>2.35986.939.61.440.3358.575.50.61HBeAg (log10 s/CO)≤3.00767.579.63.310.4194.333.10.63———————HBV DNA (log10 IU/ml)≤7.59960.579.62.960.5093.628.90.58>3.94289.992.111.350.1191.890.30.91

注：Cut-off：最佳截斷值；Sen:靈敏度；Spe：特異度；+LR：陽性似然比；-LR：陰性似然比；+PV：陽性預測值；-PV：陰性預測值；Acc：準確度。

3 討論

30余年來，慢性HBV感染的自然史研究已取得許多進展[16-19]。雖然慢性HBV感染的自然史表現(xiàn)高度異質(zhì)，但一般依次經(jīng)歷4個分期：HBeAg陽性非活動期和活動期到HBeAg陰性非活動期和活動期[20-24]。從宿主免疫與病毒的平衡狀態(tài)來概念化慢性HBV感染的自然史的4個分期，通常分為免疫耐受期和免疫清除期/免疫激活期、免疫控制期/免疫再耐受期和免疫逃逸期/免疫再激活期[16-19]。事實上，慢性HBV感染的自然史由病毒、環(huán)境和宿主因素復雜的相互作用共同決定，其發(fā)病和進展的免疫學和病毒學機制均未闡明[25-27]。

SETO等[13]研究顯示，慢性HBV感染自然史的4個分期與血清HBcrAg與HBsAg和HBV DNA均呈顯著正相關(guān)；本文也有相似結(jié)果并與MAASOUMY等[14]的研究結(jié)果一致，僅HBeAg陰性患者非活動期血清HBcrAg與HBV DNA無顯著相關(guān)性，其原因可能與血清HBcrAg與HBV DNA檢測試劑的靈敏度有關(guān)，本文分別有61.39%和51.49%的患者，其血清HBcrAg與HBV DNA低于檢測下限。但是，SETO等[13]和MAASOUMY等[14]的研究均未提及血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg的相關(guān)性。本文結(jié)果顯示，HBeAg陽性患者，非活動期血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg均無顯著相關(guān)性，活動期血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg均呈顯著正相關(guān)；HBeAg陰性患者，非活動期血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg分別呈顯著正相關(guān)和無顯著相關(guān)性，活動期血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg均無顯著相關(guān)性。慢性HBV感染自然史不同分期血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg相關(guān)性不一致的原因可能與肝臟HBsAg和HBcAg半定量計分方法的準確度有關(guān)，但本文未顯示,血清HBcrAg與肝臟HBsAg和HBcAg呈顯著負相關(guān)。提示在肝臟損傷和纖維化進展過程中，雖然HBeAg陽性與陰性患者血清和肝臟病毒學指標均呈反向演化；但無論HBeAg陽性或陰性，血清HBcrAg與其他血清和肝臟病毒學指標變化方向基本保持一致。

已發(fā)表文獻和本文結(jié)果均顯示，HBeAg陽性患者非活動期的血清病毒學指標均表現(xiàn)為最高水平；進入活動期后表現(xiàn)為差異化下降，其中，HBsAg的降幅最大，其次為HBeAg和HBcrAg，再次為HBV DNA。相反，HBeAg陰性患者非活動期的血清病毒學指標均表現(xiàn)為最低水平；進入活動期后表現(xiàn)為差異化上升，其中，HBV DNA升幅最大，其次為HBcrAg，再次為HBsAg[13-14, 28]。本文結(jié)果還顯示，HBeAg陽性患者非活動期的肝臟HBsAg和HBcAg均表現(xiàn)為高表達，進入活動期后表現(xiàn)為差異化減少，其中，HBsAg有一定程度減少，但HBcAg減少更加突出；相反，HBeAg陰性患者非活動期的肝臟HBsAg和HBcAg分別表現(xiàn)為低表達和“零”表達，進入活動期后表現(xiàn)為HBsAg進一步減少。HBeAg陽性患者，非活動期肝臟HBsAg不同水平的構(gòu)成比接近于活動期，但HBcAg≥+的比例顯著高于活動期。HBeAg陰性患者，非活動期肝臟HBsAg≥+和≥++的比例分別顯著高于和顯著低于活動期，但HBcAg不同水平的構(gòu)成比接近于活動期。非活動期患者，HBeAg陽性HBsAg≥+和≥++的比例顯著高于HBeAg陰性，且HBcAg≥+和≥++的比例也顯著高于HBeAg陰性；活動期患者，HBeAg陽性HBsAg不同水平的構(gòu)成比接近于HBeAg陰性，但肝臟HBcAg≥+和≥++的比例顯著高于HBeAg陰性。

HBeAg陽性與陰性患者血清和肝臟病毒學指標隨肝臟損傷和纖維化進展呈反向演化和差異化表達的現(xiàn)象進一步提示，HBeAg陽性與陰性患者肝炎活動的病毒學機制可能存在差異，HBsAg可能有重要的免疫調(diào)節(jié)效應，而HBcAg可能是免疫應答的主要靶標[29]。因此可以假設：HBeAg陽性階段，肝炎活動可能起因于HBsAg表達的自發(fā)性減少，導致首次激活主要針對HBcAg的免疫應答，進而導致肝臟損傷和纖維化進展，伴隨HBV復制下降和抗原表達減少；首次免疫應答持續(xù)直到發(fā)生HBeAg顯著減少或轉(zhuǎn)換，并維持針對HBcAg的免疫應答和針對HBsAg的免疫耐受；HBeAg陰性階段，肝炎活動可能起因于HBV復制的機會性增加，導致再次激活針對HBcAg的免疫應答，進而導致肝臟再損傷和纖維化再進展，伴隨HBV復制再下降和抗原表達再減少；再次免疫應答持續(xù)直到發(fā)生HBsAg顯著減少或轉(zhuǎn)換，并維持針對HBcAg和HBsAg免疫應答。因此可以推斷，慢性HBV感染自然史可以分為5個連續(xù)分期：針對HBsAg免疫耐受期、針對HBcAg的免疫激活期、針對HBsAg的再耐受期、針對HBcAg的免疫再激活期、針對HBsAg的免疫清除期。

本文ROC曲線分析顯示，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA對HBeAg陽性和陰性患者活動期均有顯著的預測意義。其中，血清HBsAg和HBV DNA分別對HBeAg陽性和陰性患者活動期的預測效能最大；無論HBeAg陽性或陰性，血清HBcrAg對活動期的預測效能均介于血清HBsAg與HBV DNA之間，且分別顯著低于血清HBsAg和HBV DNA。

總之，本文探討了血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA在慢性HBV感染自然史中的變化。結(jié)果顯示，HBeAg陽性慢性HBV感染，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA從非活動期到活動期呈現(xiàn)差異化下降，其中，HBcrAg降幅分別小于HBsAg和大于HBV DNA；相反，HBeAg陰性慢性HBV感染，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA從非活動期到活動期呈現(xiàn)差異化上升，其中，HBcrAg升幅分別大于HBsAg和小于HBV DNA。