張 婕，金 泉，吳素玲，管 明

(1.浙江省杭州市兒童醫(yī)院內(nèi)二科 310014；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科 310006)

低氧性肺動(dòng)脈高壓是一種慢性進(jìn)行性疾病，其中低氧是該病發(fā)生的最主要原因。肺動(dòng)脈血管收縮、肺血管重構(gòu)及微血管損傷是低氧性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病機(jī)制[1-2]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)是肺動(dòng)脈壁的主要構(gòu)成細(xì)胞。PASMCs的增殖和凋亡平衡影響肺血管的厚度，是肺血管重塑的主要機(jī)制之一[3]。研究低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效安全的治療方法一直是研究的熱點(diǎn)。

含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain,ARC)是一種高效及多功能的調(diào)節(jié)內(nèi)外源性凋亡的抗凋亡蛋白[4]。ARC可以拮抗由細(xì)胞毒性藥物、放射性損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺氧、細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡失調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等引起的凋亡[5]。由于ARC對于PASMCs生長與肺血管重塑的影響并不明確，本研究主要通過干擾ARC的表達(dá)，探討是否影響下游反應(yīng)元件的激活，最終通過一系列內(nèi)外源性抗凋亡因子的表達(dá)，使得機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境的變化。因此，本研究通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)，體外干擾PASMCs ARC的表達(dá)，檢測細(xì)胞活力變化，討論ARC在PASMCs生長中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購于美國HyClone公司；OPTI-MEM購于美國Gibco公司;青、鏈霉素(100×)購于上海碧云天生物技術(shù)公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于美國Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于(H+L)索萊寶公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購于美國BD公司； BCA蛋白定量試劑盒購于南京維森特生物技術(shù)公司；吐溫20(Tween-20)購于上海生工生物工程公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體、β-actin抗體、ARC抗體購于美國Santa Cruz公司;CCK-8購于北京普魯頓公司。

1.2方法

1.2.1大鼠PASMCs的分離、培養(yǎng)及分組 大鼠PASMCs的培養(yǎng)和鑒定采用膠原酶Ⅰ消化法[9]。取SD大鼠，超凈臺內(nèi)處死，取肺組織，分離肺內(nèi)動(dòng)脈血管于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。分離出血管中膜，用眼科剪將血管中膜剪碎，放入預(yù)先盛有含0.2%膠原酶Ⅰ的離心管中離心，棄上清液后將沉淀組織重懸于5 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)皿中于培養(yǎng)箱中孵育。一般約1周平滑肌細(xì)胞可從組織塊中爬出，待細(xì)胞即將融合時(shí)，進(jìn)行消化傳代，取2～3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將PASMCs分成以下4組：常氧組、低氧組、ARC-siRNA+低氧組、Negative-siRNA+低氧組。

1.2.2免疫熒光染色法檢測ARC、caspase-3表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的PASMCs細(xì)胞接種至12孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基。取細(xì)胞PBS洗滌1次，多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫孵育10 min。PBS洗滌3次，加入含0.2% TritonX-100,室溫靜置30 min。PBS洗滌3次，加入約40 μL一抗(ARC 1∶1 000、caspase-3 1∶1 000、α-SMA 1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。除去未結(jié)合的一抗，PBS洗滌后加入二抗，靜置 30 min， PBS洗滌。隨后用DAPI染核5 min，PBS洗滌，用尖鑷子將玻片取出，晾干，載玻片上滴一滴封片液。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 PASMCs接種于6孔板中，待細(xì)胞長至70%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次，無血清培養(yǎng)基洗2次，加入新的無血清培養(yǎng)基，將Lipofectamine2000、ARC-siRNA(ARC-siRNA 1、2、3)或陰性對照序列(Neigative-siRNA)分別加入細(xì)胞中，充分混勻，培養(yǎng)48 h后，換液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ARC的3個(gè)siRNA oligo序列見表1。

表1 各siRNA序列

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力 收集細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化，稀釋細(xì)胞使其濃度為3×107/L。分別取100 μL于96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常氧培養(yǎng)過夜貼壁。在常氧或低氧條件下將各組細(xì)胞分別培養(yǎng) 0、24、48、72 h后，按1∶10體積比混合CCK-8和無血清DMEM培養(yǎng)基，取100 μL加入待測孔中，37 ℃、5% CO2孵育1 h；用微板分光光度計(jì)測定450 nm波長下的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上靜置裂解20 min；4 ℃ 10 000×g 離心5 min,取上清液，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上樣緩沖液水浴(100 ℃)變性10 min，樣本備用或分裝凍存。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，100 V轉(zhuǎn)移至PDVF膜，封閉液中封閉1 h；加入一抗[分別為ARC抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶500)]室溫孵育2 h；洗膜；放入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h；PBST洗膜，在暗室中加ECL發(fā)光試劑，X射線膠片曝光1～2 min后顯影、定影，雜交信號在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用管家基因β-actin作為內(nèi)參，其余目的蛋白與其的比值對目的蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 各基因RT-PCR引物

1.2.6RT-PCR TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，合成cDNA。紫外吸收法測定總RNA在260 nm和280 nm處A值，計(jì)算其濃度和純度。用PCR擴(kuò)增目的片段。以GADPH mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物在1.5%～1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，條帶經(jīng)紫外顯色灰度掃描。各基因RT-PCR引物見表2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1siRNA在PSCMCs中抑制ARC表達(dá)的效率檢測 常氧下，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)ARC在PSCMCs的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均存在表達(dá)，見圖1。常氧下，ARC-siRNA干擾后，ARC在PSCMCs中的表達(dá)水平經(jīng)RT-qPCR檢測，結(jié)果顯示：相對于對照細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染siRNA，常氧，ARC表達(dá)水平設(shè)為100%),ARC-siRNA1,ARC-siRNA2,ARC-siRNA3作用后，ARC mRNA的表達(dá)水平分別為(46.8±3.0)%、(42.6±6.9)%、(50.7±10.0)%，其中ARC-siRNA 2抑制ARC表達(dá)的效率最高 (圖2A)。Western blot、免疫熒光染色檢測ARC-siRNA2干擾，ARC在PSCMCs的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARC在ARC-siRNA2干擾后的細(xì)胞中表達(dá)較對照細(xì)胞顯著下降(圖2B、C)。因此最終選取ARC-siRNA2來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 ARC在PACMCs中表達(dá)(熒光顯微鏡×800)

A:ARC mRNA表達(dá)量被ARC-siRNA1、ARC-siRNA2、ARC-siRNA3轉(zhuǎn)染后所抑制;B:Western blot結(jié)果顯示 ARC表達(dá)水平在ARC-siRNA2干擾后顯著下降;C:免疫熒光結(jié)果顯示ARC表達(dá)水平在ARC-siRNA2干擾后顯著下降。a:P<0.05

圖2ARC-siRNA抑制ARC在PASMCs中的表達(dá)(熒光顯微鏡×400)

2.2ARC對低氧下PASMCs細(xì)胞活力的影響 CCK-8法檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示低氧明顯促進(jìn)PASMCs活力(P<0.01)，且呈時(shí)間依賴性，各組在0 h時(shí)A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在低氧情況下，ARC-siRNA+低氧組的A值較Negative-siRNA+低氧組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3低氧下PASMCs中caspase-3表達(dá)水平變化及與ARC的關(guān)系 為了進(jìn)一步研究ARC對低氧下PASMCs活力影響的機(jī)制，筆者采用免疫熒光染色檢測了caspase-3在低氧作用后表達(dá)水平變化。免疫熒光染色結(jié)果顯示，低氧作用48 h，低氧組caspase-3陽性細(xì)胞較常氧組顯著增加[(22.4±5.2)%vs.(5.5±1.8)%]。用ARC-siRNA下調(diào)ARC表達(dá)，再低氧作用48 h，免疫熒光染色結(jié)果顯示ARC-siRNA組與Negative-siRNA組比較，caspase-3陽性細(xì)胞顯著增加[(50.1±5.8)%vs. (17.2±4.1)%]。結(jié)果表明，ARC干擾后，PASMCs對低氧敏感度增加，可能與caspase-3表達(dá)增加有關(guān)。見圖3。

表3 CCK-8法測量不同分組下PASMCs細(xì)胞活力情況值)

a：P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05，與Negative-siRNA+低氧組比較

圖3 ARC表達(dá)抑制后低氧條件下PASMCs中caspase-3表達(dá)水平變化(熒光顯微鏡×800)

2.4低氧下PASMCs凋亡通路中多種凋亡因子表達(dá)水平及與ARC的關(guān)系 低氧作用48 h后，低氧組caspase-3 mRNA表達(dá)水平較常氧組顯著增加，且內(nèi)源性促凋亡因子Bad、 Fadd表達(dá)顯著增加，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ARC-siRNA+低氧組與Negative-siRNA+低氧組比較，caspase-3和Fadd表達(dá)均顯著增加，Bcl-2表達(dá)則顯著下降(P<0.05)，而Bad表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

a：P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05 ，與Negative-siRNA+低氧組比較

圖4ARC表達(dá)抑制后低氧條件下凋亡因子表達(dá)水平變化

3 討 論

低氧性肺動(dòng)脈高壓是由低氧血癥引起的肺動(dòng)脈壓力升高，是一種慢性進(jìn)行性疾病，其主要病理特征為肺動(dòng)脈壓力持續(xù)增高、肺動(dòng)脈壁的增厚及血管肌化，目前其治療手段和效果有限，預(yù)后極差，常導(dǎo)致患者右心心力衰竭而死亡[1]。其中低氧是該病發(fā)生的最主要原因。肺動(dòng)脈血管收縮、肺血管重構(gòu)及微血管損傷是低氧性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病機(jī)制[2]。低氧性肺血管重建是低氧性肺動(dòng)脈高壓的主要病理改變，PASMCs是構(gòu)成肺動(dòng)脈壁的主要細(xì)胞，PASMCs增殖和凋亡失衡是肺血管重塑的主要機(jī)制，而細(xì)胞活力的變化能從側(cè)面說明反映細(xì)胞增殖凋亡情況。

ARC是1998由KOSEKI等[4]首次發(fā)現(xiàn)并命名是一種高效及多功能的調(diào)節(jié)內(nèi)外源性凋亡途徑的抗凋亡因子。ARC含有兩個(gè)功能區(qū)域：CARD和P/E，CARD區(qū)同凋亡因子caspase的CARDS區(qū)及凋亡受體蛋白RAIDD和Apaf-1具有同源性。ARC通過與caspase或其受體蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)凋亡信號，維持其線粒體膜電位的穩(wěn)定，抑制線粒體釋放活性氧[5]。在心肌細(xì)胞缺血再灌注模型中，ARC缺陷的小鼠，心肌細(xì)胞損傷更加顯著[6-7]。而過表達(dá)ARC可保護(hù)心肌因缺血再灌注引起的損傷[8-9]。ARC參與細(xì)胞程序性死亡、凋亡、遷移等行為的調(diào)控，維持線粒體膜電位的穩(wěn)定[5,10-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)ARC在PASMCs表達(dá)，對于低氧性肺動(dòng)脈高壓研究顯示，低氧促進(jìn)PASMCs活力，凋亡減少，增殖增加[14]，在肺血管重塑中發(fā)揮著重要作用，這與本研究的研究結(jié)果相符。本研究用轉(zhuǎn)染法將外源性siRNA導(dǎo)入PASMCs構(gòu)建ARC干擾模型，在經(jīng)過體外轉(zhuǎn)染PASMCs并做篩選后，選定轉(zhuǎn)染效率最好的靶點(diǎn)2(ARC-siRNA2)，采用免疫熒光來檢查轉(zhuǎn)染結(jié)果，結(jié)果顯示ARC表達(dá)顯著降低，說明轉(zhuǎn)染模型構(gòu)建成功。研究結(jié)果顯示ARC對PASMCs活力可能具有一定的增強(qiáng)作用，低氧下PASMCs細(xì)胞活力較常氧下增加。低氧下，當(dāng)ARC受到抑制時(shí)，細(xì)胞活力受抑制；本研究顯示這一結(jié)果可能與多種因子相互作用有關(guān)，當(dāng)ARC表達(dá)被抑制時(shí)，促凋亡因子caspase-3和Fadd表達(dá)顯著增加，抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)降低，而促凋亡因子Bad無明顯變化。