楊自華,張婕婕,何桂蓉,宋 麗

(深圳市人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518020)

慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(CITP)又稱慢性免疫性血小板減少癥，其病程持續(xù)時間大于或等于12個月，是一種發(fā)病機制尚未明確的自身免疫性疾病，常伴有抗血小板自身抗體及血小板減少等特征，除了體液免疫因素外，細胞免疫因素在其發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。目前，自身抗體與Tfh細胞的數(shù)量變化及其分泌的重要效應(yīng)細胞因子IL-21的異常表達，在免疫性血小板減少癥的研究中廣受關(guān)注[1-5],本研究擬通過觀察CITP患者血液中濾泡輔助性T細胞(Tfh)細胞數(shù)量變化及其分泌的重要效應(yīng)細胞因子IL-21的水平，與自身抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPIb/Ⅸ血小板抗體的表達情況，初步探討其與CITP的發(fā)病機制的關(guān)系與臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取CITP患者30例作為CITP組，男12例、女18例，年齡15～65歲，中位年齡為40歲，為2016年2月至2018年3月于本院住院的患者。所有受試者均符合慢性ITP的診斷標準[6]。測試前一個月所有患者禁止使用影響試驗結(jié)果的相關(guān)藥物，如糖皮質(zhì)激素、細胞毒藥物等，采血前24 h嚴格禁藥，均不伴有高血壓、糖尿病及結(jié)核等慢性感染性疾病，血小板計數(shù)為(1～32)×109/L。另外，選取本院健康體檢者30例作為對照組，男女各15例，年齡18～56歲，中位年齡39歲，均無腫瘤與自身免疫性疾病，血小板計數(shù)為(156～322)×109/L。

2 結(jié) 果

2.1CD4+T細胞及CD4+T細胞中CXCR5+CD4+T細胞比例檢測 經(jīng)流式細胞術(shù)檢測,CITP組與對照組CD4+T細胞比例分別為(32.5±0.12)%、(33.3±0.13)%，差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)；但CITP組外周血中CXCR5+CD4+T細胞占CD4+T細胞的比例明顯高于對照組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.695，P<0.05)，見表1。

表1 兩組間CD4+T細胞及CD4+T細胞中CXCR5+CD4+T細胞比例

注：*P<0.05，與對照組比較

2.2IL-2、血小板膜糖蛋白特異性抗體的檢測 CITP組IL-21水平[(183.0±36.2)pg/mL]高于對照組[(126.0±24.9) pg/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.461，P<0.01)。30例CITP患者中出現(xiàn)抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPIb/Ⅸ抗體陽性例數(shù)分別為14例(46.7%)和13例(43.3%)。與對照組比較，CITP組血小板特異性抗體(抗GPⅡb/Ⅲa與 GPIb/Ⅸ抗體)陽性者A值更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3血漿IL-21水平與血小板膜糖蛋白特異性抗體的相關(guān)性分析 IL-21與抗GPⅡb/Ⅲa 、抗GPIb/Ⅸ抗體水平進行相關(guān)性分析，r分別為0.686和0.395，IL-21水平與抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPIb/Ⅸ抗體呈正相關(guān)。

表2 血清IL-21的表達水平及血小板自身抗體A值檢測結(jié)果比較

注：*P<0.05，與對照組比較

3 討 論

目前，國內(nèi)外學(xué)者對CITP的研究常集中于T細胞亞群或有關(guān)細胞因子的研究，在其發(fā)病機制研究中，有學(xué)者通過對T細胞亞群分化中參與的效應(yīng)細胞因子，如IL-21活化的有關(guān)基因表達與關(guān)鍵蛋白分析，發(fā)現(xiàn)其在急性特發(fā)性血小板減少性紫癜或CITP中具有鑒別診斷意義[8-9]。也有學(xué)者對CTIP患者中血小板減少的原因進行分析，但其減少的機制并沒有完全明確[10]。近年來，學(xué)者們普遍認為，CITP患者體內(nèi)存在一種或多種抗血小板自身抗體，其可以與血小板表面靶向抗原相結(jié)合，在不同程度上激活單核巨噬系統(tǒng)，進而導(dǎo)致血小板破壞，致使其數(shù)量減少[11]。筆者推測，與健康人群相比，CITP患者Tfh細胞的數(shù)量與比例上可能存在著差異，其細胞因子、抗血小板自身抗體出現(xiàn)了異常。

Tfh是新近報道的一種CD4+T細胞亞群，其分子表型為 CXCR5+CD40L+ICOS+，在Tfh自分泌或外分泌的IL-21共同作用下，促進 B細胞增殖、分化以及免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換[12]。本研究表明，相較于健康人群，CITP患者Tfh細胞比例明顯增加，這與有關(guān)學(xué)者的研究基本一致[13]，有研究還發(fā)現(xiàn)CITP患者Tfh細胞的過度活化與血小板數(shù)量呈負相關(guān)，阻斷Tfh細胞活化路徑可對CITP的治療產(chǎn)生作用，因此推測Tfh細胞在CITP疾病過程中可能也發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，與對照相比，有著高表達的ICOS與PD-1的CXCR5+CD4+Tfh的比例在患者中顯著增高,進而表明，Tfh細胞主要定位于異位生發(fā)中心(GC)，不僅表達CXCR5，也表達PD-1、ICOS、CD40L等效應(yīng)分子，并具有相對特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BCL-6，以及行使功能的主要產(chǎn)物IL-21[14]。本研究中，CITP患者血液中 CXCR5+CD4+T細胞在CD4+T細胞中的比例明顯高于對照組，說明Tfh在CITP患者存在高表達，提示Tfh可能在CITP患者在病理狀態(tài)下有異常增殖表現(xiàn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CITP組IL-21的水平高于對照組，提示IL-21 的水平可能影響Tfh細胞的分化，間接導(dǎo)致了T細胞介導(dǎo)的慢性自身免疫性疾病的發(fā)生。有文獻報道，IL-21能維持GC中B細胞存活和增殖，誘導(dǎo)抗體類別轉(zhuǎn)換和免疫球蛋白的產(chǎn)生[15]，結(jié)合本研究中CITP患者Tfh細胞比例明顯增加，IL-21濃度明顯升高的結(jié)果，筆者推測Tfh細胞及IL-21可能參與CITP的發(fā)病過程。

針對CITP患者，血小板膜表面糖蛋白(GP)抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)的研究是一大熱點,本研究通過改良MAIPA法，對GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ特異性抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)其A值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合先前的研究，筆者推測：在CITP患者中Tfh細胞數(shù)量的增加與過度活化，可引起細胞免疫失衡，導(dǎo)致大量血小板自身抗體產(chǎn)生，從而引發(fā)血小板破壞增加、數(shù)量減少。通過本研究，相對健康人群，CITP患者可能存在Tfh細胞的異常，在Tfh自分泌或外分泌的IL-21共同作用下，抗血小板特異性自身抗體可能參與CITP發(fā)生發(fā)展過程。

目前,CITP尚無可供應(yīng)用的“金標準”以明確其診斷，大部分為排除性診斷,客觀上需要排除自身免疫性疾病和其他原因所致繼發(fā)性血小板數(shù)量降低或血小板功能不足才能診斷。針對CITP患者，血小板膜表面糖蛋白(GP)抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)的研究是一大熱點,其檢測方法主要有微流控技術(shù)、單克隆抗體俘獲血小板抗原技術(shù)(如MAIPA)或者放射免疫微球技術(shù)等。本研究通過改良MAIPA法，對GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ特異性抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)其A值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合先前的研究，筆者推測：在CITP患者中，Tfh細胞數(shù)量的增加與過度活化，可引起Tfh細胞免疫失衡，導(dǎo)致大量血小板自身抗體產(chǎn)生，從而引發(fā)血小板破壞增加、數(shù)量減少，通過Tfh細胞分泌的重要效應(yīng)細胞因子IL-21與血小板特異性自身抗體(GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ)相關(guān)性分析，證明兩者存在密切聯(lián)系，提示CITP中IL-21的異常表達與血小板特異性自身抗體是并存的，只不過GPⅡb/Ⅲa或GPIb/Ⅸ性質(zhì)不同，可能因為其來源于不同蛋白質(zhì)家族，破壞血小板的途徑不同，其相關(guān)性也就不同，其對于CITP的發(fā)病機制研究具有積極意義。

綜上所述，本實驗研究探討了CITP患者Tfh細胞的變化、效應(yīng)細胞因子IL-21的水平及與血小板特異性自身抗體相關(guān)性，結(jié)果表明，這些因素的參與提示其可能與CITP的發(fā)病機制有關(guān)，其可為臨床診斷與治療提供一種思路。