邵 瓊,蘇瑞芬,許 海

(1.湖北省來鳳縣人民醫(yī)院婦產科,湖北恩施 445700;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院婦產科，湖北恩施 445000;3.湖北中醫(yī)藥大學黃家湖醫(yī)院婦科，湖北武漢 430070)

宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中高居第二，除手術治療外，化療也是重要的治療手段之一[1]，順鉑是臨床上治療宮頸癌的一線化療藥物，但由于各種復雜的機制，相當一部分患者會因為對順鉑產生耐藥性而導致化療失敗[2-3]。增加耐藥細胞對順鉑的敏感性是挽救耐藥病例的一個重要研究思路。研究發(fā)現微小RNA(miRNA)在宮頸癌中表達異常[4]。microRNA 是一類非編碼單鏈小RNA，核苷酸長度為18～25個，可以通過調控活性靶點而參與腫瘤的發(fā)生[5]。其中miRNA-218(miR-218)在宮頸癌中的表達顯著降低，可能是潛在的腫瘤抑制因子[6]。目前，有關miR-218對于耐藥宮頸癌細胞作用的研究較少。本研究建立了耐順鉑的宮頸癌細胞株，并使其過表達miR-218，觀察了耐藥細胞生物學特性的改變，取得了一定的研究成果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人宮頸癌細胞SiHa細胞系購于北京中原公司；順鉑購于齊魯制藥公司；DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶購于Gibco公司；慢病毒載體質粒、miRNA-218基因片段購于上海吉瑪公司；miRNA快速提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購于北京天根公司。流式細胞儀為美國BD公司生產。Transwell小室由美國Corning公司生產。

1.2細胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，將SiHa細胞置于培養(yǎng)基中，當細胞融合率達到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，于5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，保持恒溫37 ℃。

1.3耐順鉑宮頸癌細胞株培養(yǎng) 通過持續(xù)緩慢增加順鉑濃度的方法建立耐藥細胞株[7]，在SiHa細胞培養(yǎng)液中加入0.1 μg/mL低濃度的順鉑，持續(xù)作用2周后，待細胞可在此濃度中穩(wěn)定生長，再將順鉑濃度增加至0.5 μg/mL，6周后增加至1.0 μg/mL，12周后加至1.5 μg/mL，8周后加至2.0 μg/mL，11周后觀察在培養(yǎng)液中仍穩(wěn)定增殖的細胞株即為耐順鉑SiHa細胞株(耐順鉑SiHa)。

1.4miR-218過表達耐順鉑SiHa細胞株建立及表達檢測 將miR-218 序列和陰性對照序列擴增并克隆到慢病毒質粒LV3上，miR-218 基因片段為5′-TTG TGC TTT TGT GCT TGA TCT AAC CAT GT-3′，陰性對照為5′-TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTT C-3′，嚴格按照產品操作手冊進行轉染耐順鉑SiHa細胞，在96孔板中每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，接種耐順鉑SiHa細胞3.5×103，感染細胞病毒滴度為1×107TU/mL，并加入0.5 g/L的聚凝胺，72 h后用熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)光情況，加入1.2 mg/L嘌呤霉素殺死未轉染細胞，篩選出的細胞即為過表達miR-218的耐順鉑SiHa細胞株(miR-218/耐順鉑SiHa)，期間根據細胞的生長狀況進行傳代培養(yǎng)。獲得穩(wěn)定生長表達的細胞株后，按照miRNA快速提取試劑盒說明嚴格操作，提取SiHa、耐順鉑SiHa、miR-218/耐順鉑SiHa 3組細胞的RNA，逆轉錄合成cDNA，按照逆轉錄試劑盒進行擴增，采用熒光定量PCR試劑盒檢測各組細胞miRNA-218的表達量。

1.5MTT法檢測細胞在順鉑中的增殖情況 采用0.25%胰蛋白酶消化SiHa、耐順鉑SiHa、miR-218/耐順鉑SiHa 3組細胞，調整細胞數量，離心后接種于96孔板，同時采用0.4 μg/mL的順鉑處理，采用MTT法測定吸光度(A)值 ，連續(xù)測量7 d，根據A值繪制生長曲線反映細胞增殖活力。

1.6順鉑藥物敏感性測定 采用0.25%胰蛋白酶消化3組細胞，調整細胞數量，離心后接種于96孔板，并分別用0、0.000 4、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/mL濃度順鉑處理，72 h后采用MTT法測定吸光度，計算IC50。

1.7劃痕試驗 將細胞接種于96孔板中，采用3%胎牛血清培養(yǎng)，待細胞匯合達85%時，用移液槍槍頭沿孔底做一直徑的筆直劃痕，并吹走劃落細胞，分別在0、24 h時在200倍顯微鏡下觀察和測量劃痕閉合寬度。

1.8Transwell法測定細胞侵襲能力 0.25%胰蛋白酶消化3組細胞，調整細胞數量，使用無血清培養(yǎng)基重懸，在小室下室加入10%血清培養(yǎng)基600 μL，小室上室加入150 μL細胞懸液，放入5%CO2的培養(yǎng)箱中，恒溫37 ℃培養(yǎng)10 h后甲醛固定小室，結晶紫染色，底膜切片移至載玻片中性樹膠封片，200倍光鏡下隨機取5個視野計數細胞數取平均值，即為穿膜細胞數。

1.9統計學處理 應用SPSS19.0分析軟件，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組細胞miR-218的表達量 以SiHa組細胞為對照組,其miR-218的相對表達量為1.00±0.00。miR-218/耐順鉑SiHa組細胞的miR-218相對表達量為5.26±0.34，顯著高于SiHa組(t=20.65,P<0.05)。耐順鉑SiHa組細胞的相對表達量為1.43±0.21，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，低于miR-218/耐順鉑SiHa組(t=18.76,P<0.05)。耐藥株細胞的miR-218表達量與親本株差異無統計學意義，SiHa細胞發(fā)生耐藥的過程可能無miR-218參與，轉染miR-218后表達量顯著增加，證實轉染成功。

2.2各組細胞在順鉑中的增殖克隆及IC50在含0.4 μg/mL的順鉑培養(yǎng)液中，采用MTT法檢測細胞增殖情況，連續(xù)5 d，根據所測得的A值繪制生長曲線，見圖1。在1～2 d，3組細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05)；3～5 d時，耐順鉑SiHa組的增殖顯著高于miR-218/耐順鉑SiHa組，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-218/耐順鉑SiHa組與SiHa組之間增殖水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。耐順鉑SiHa 組的IC50顯著高于SiHa組[(0.15±0.03)μg/mL]與miR-218/耐順鉑SiHa組[(0.23±0.06)μg/mL]。

注：從上到下的三條生長曲線依次為耐順鉑SiHa組、SiHa組、miR-218/耐順鉑SiHa組圖1 各組細胞生長曲線

2.3劃痕試驗 分別在0、24 h時在200倍顯微鏡下觀察和測量劃痕閉合寬度，SiHa、耐順鉑SiHa、miR-218/耐順鉑SiHa組的劃痕愈合率分別為(28.16±2.14)%、(29.35±1.86)%、(13.45±1.02)%，miR-218/耐順鉑SiHa組劃痕愈合率顯著低于SiHa與耐順鉑SiHa組,差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 劃痕試驗檢測各組細胞遷移能力(200×)

2.4細胞侵襲能力 200倍光鏡下觀察小室底膜細胞數，SiHa、耐順鉑SiHa、miR-218/耐順鉑SiHa組細胞穿膜數分別為123.40±21.65、132.50±22.32、78.90±12.54，miR-218/耐順鉑SiHa組細胞穿膜數顯著低于SiHa與耐順鉑SiHa組,差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Transwell法測定細胞侵襲能力(200×)

3 討 論

從組織學分類，宮頸癌屬于鱗癌，人宮頸鱗癌SiHa細胞是最常用于腫瘤研究的細胞系之一。順鉑作為宮頸癌化療的一線藥物效果顯著，但臨床一旦發(fā)生耐藥，治療效果將會受到巨大影響。宮頸癌耐藥的發(fā)生可能與化療藥物進入腫瘤細胞減少或溢出增多，藥物在腫瘤細胞內活性減弱，化療藥物作用的靶分子改變，腫瘤DNA損傷修復能力增強，腫瘤細胞凋亡抑制相關[8]。宮頸癌細胞耐藥的機制尚不明確，目前認為這些機制或多或少參與了宮頸癌耐順鉑的過程中。有學者發(fā)現耐藥株細胞學形態(tài)發(fā)生了改變，可能通過這種改變增加代謝，增強自身修復能力[9]。建立耐藥株模型，研究增加耐藥株對藥物敏感性的方法具有重大科研和臨床價值。耐藥株的建立目前有兩種方法，一是低濃度持續(xù)加量誘導法，優(yōu)點是細胞耐藥性較穩(wěn)定成功率高；另一種方法是大劑量沖擊間斷給藥法，優(yōu)點是更接近于臨床耐藥發(fā)生過程。在研究了諸多文獻后，本研究采取了前者的造模方式，經過40周的培養(yǎng)，成功獲得了耐順鉑SiHa細胞株。

miRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，miRNA是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA,可通過與多個靶基因的mRNA的3′端的非翻譯區(qū)發(fā)生不完全的互補配對,并在轉錄后抑制基因的表達。OLIVETO等[10]報道，miRNA可通過擴增表達或減少表達來實現對癌癥的抑制，幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的每一個步驟,在腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。50%以上的miRNAs定位于腫瘤的相關基因組區(qū)域內,并可由染色體異常而導致miRNAs基因拷貝數的改變,進而出現miRNAs的表達失調。幾乎所有的腫瘤組織內均可檢測出miRNAs的異常表達。miR-218在乳腺癌、肝細胞癌、神經膠質瘤等諸多惡性腫瘤中表達下降[11-13]，JIANG 等[14]研究報道宮頸癌患者血清中miR-218表達量顯著低于正常婦女，崔英等[15]發(fā)現宮頸癌組織中miR-218的表達量顯著高于正常宮頸組織，石玉榮等[16]發(fā)現miR-218可以預測宮頸癌的侵襲性，其高表達可能抑制宮頸癌細胞的遷移。在本研究中，將miR-218基因通過慢病毒感染的方式轉染入耐藥SiHa細胞株，通過PCR熒光定量檢測，發(fā)現miR-218/耐順鉑SiHa細胞株中miR-218的表達量顯著增加，同時發(fā)現親本株細胞與耐藥株細胞的miR-218表達量差異無統計學意義(P>0.05)，說明耐藥的發(fā)生可能與miR-218表達量無關。在含有一定量順鉑的培養(yǎng)基中miR-218/耐順鉑SiHa的增殖速度和IC50顯著低于耐藥株，但與親本株無差異，說明雖然耐藥的發(fā)生過程與miR-218無關，但過量表達miR-218后可以增加耐藥株細胞對順鉑的敏感性。之后的劃痕試驗和Transwell試驗均證實了miR-218對耐藥株細胞遷移和侵襲能力的抑制，這與目前大多研究結果相一致。

本研究通過持續(xù)緩慢增加順鉑濃度的方法成功構建了SiHa耐藥株，慢病毒轉染法建立了過表達miR-218的SiHa細胞株及耐藥株。與SiHa及耐順鉑SiHa相比，miR-218/耐順鉑SiHa細胞株的miR-218表達量顯著升高；在含有順鉑培養(yǎng)液中，耐順鉑SiHa的克隆增殖與IC50顯著高于SiHa與miR-218/耐順鉑SiHa，miR-218/耐順鉑SiHa的劃痕愈合率與細胞穿膜次數顯著低于SiHa及耐順鉑SiHa。

4 結 論

miR-218基因可能不參與宮頸癌細胞的耐藥發(fā)生，但對于已經發(fā)生耐藥的宮頸癌細胞，轉染miR-218基因后使基因過表達miR，則可以增加對順鉑的敏感性，同時遷移和侵襲能力下降，對于臨床耐藥而導致化療失敗的患者而言，提供了一條新的科研和治療思路。