劉建兵 李文龍 郝建卿 崔小華 林曉雨 李 莉

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室 山西太原 030001）

生物信息學(xué)是由生命科學(xué)和信息技術(shù)等學(xué)科相結(jié)合形成的新興交叉學(xué)科。利用生物信息學(xué)技術(shù)，以基因組DNA 序列信息分析作為源頭，獲得蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測(cè)，然后依據(jù)特定蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行更深入的研究與應(yīng)用。白介素-32（Interleukin-32，IL-32）是一種新近發(fā)現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子［1］，其蛋白序列與其他細(xì)胞因子不存在同源性，并且在嚙齒類物種中也未找到與其同源的蛋白［2］。IL-32 在人不同組織或器官中都有表達(dá)，其中包括脾臟、胸腺、白細(xì)胞、肺、小腸、結(jié)腸、心臟、胎盤(pán)、肝臟、肌肉、腎臟、胰腺和腦等［3］。研究表明，IL-32 在炎癥性疾病、感染性疾病及癌癥發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用［3-4］。本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)人IL-32蛋白的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及蛋白相互作用等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，為進(jìn)一步了解IL-32 基因功能

機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 IL-32 的氨基酸序列進(jìn)行分析（GenBank 登錄號(hào)：AAH09401.1）。

1.2 方法 采用 ProtParam［5］（https://web.expasy.org／protparam／）軟件對(duì) IL-32 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用ProtScale［5］（https://web.expasy.org／protscale／）軟件對(duì)其疏水性進(jìn)行分析；采用SignalP 4.0［6］（http://www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）對(duì)其信號(hào)肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用SecretomeP 2.0 server［7］（http://www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）對(duì)其進(jìn)行非經(jīng)典型分泌蛋白預(yù)測(cè)；采用在線程序 TMHMM Server v.2.0［8］（http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用在線軟件NetNGlyc 1.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk／services/NetNGlyc／） 和 Net -OGlyc 4.0 Server［9］（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）對(duì)其N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用在線軟件YinOYang1.2 Server［10］（http://www.cbs.dtu.dk／services／YinOYang／）對(duì)其 O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用在線軟件 Netphos 2.0 Server［11］（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos-2.0／）對(duì)其磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用在線軟件 PSORTⅡ［12］（https://psort.hgc.jp／form2.html）對(duì)其亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè)；采用 在線軟件 STRING［13］（https://string-db.org／）對(duì)其蛋白網(wǎng)絡(luò)互作進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-32 蛋白的理化性質(zhì)分析 利用在線生物信息學(xué)軟件ProtParam 對(duì)IL-32 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示其蛋白分子量（Mr）=26676.35，蛋白分子式 C1177H1814N318O355S18，理論等電點(diǎn)PI=5.14，屬于酸性蛋白。組成IL-32 蛋白的氨基酸有20 種，其中亮氨酸（Leu）含量最高，占總氨基酸的10.3%，異亮氨酸含量最少，只有0.4%（圖1）。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為35 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)為26 個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)為56.33，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性平均總值為-0.495，脂肪指數(shù)為67.52。通過(guò)在線軟件 ProtScale 分析顯示，IL-32 氨基酸序列的第184 位疏水性最大分值為1.944，第222 位親水性最大分值為-2.256，整體親疏水性預(yù)測(cè)顯示IL-32 蛋白為親水性蛋白（圖2）。

圖1 IL-32 蛋白氨基酸的組成

圖2 IL-32 蛋白親水性與疏水性分析

2.2 IL-32 蛋白的信號(hào)肽分析 生物信息學(xué)在線軟件SignalP 4.0 被廣泛應(yīng)用于蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，結(jié)果包含了 C 值、Y 值和 S 值。其中通過(guò) S 平均值判斷分泌蛋白（若S 平均值高于0.500，則為分泌蛋白，且存在信號(hào)肽）；C 值是剪切位點(diǎn)值；Y值是綜合考慮C 值和S 值后的一個(gè)參數(shù)，可更準(zhǔn)確判斷信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。IL-32 蛋白氨基酸序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示C 值最大為0.168、Y 值最大為 0.206、S 平均值為 0.226。由此推測(cè)，IL-32 蛋白不存在信號(hào)肽序列，不是經(jīng)典的分泌型蛋白（圖3）。

圖3 IL-32 蛋白的信號(hào)肽分析

2.3 非經(jīng)典型分泌蛋白預(yù)測(cè) SecretomeP 2.0 server 是預(yù)測(cè)非經(jīng)典分泌型蛋白的專業(yè)軟件，結(jié)果評(píng)價(jià)主要參考NN-score，哺乳動(dòng)物序列的閾值為0.6［8］。利用 SecretomeP 2.0a Server SecretomeP 2.0 Server 對(duì) IL-32 蛋白氨基酸序列預(yù)測(cè)，NN-score 為0.534。由此判斷，IL-32 不是非經(jīng)典型分泌蛋白。

2.4 IL-32 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析 利用在線生物信息學(xué)軟件TMHMM Server v.2.0 對(duì)IL-32 蛋白氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明：IL-32 蛋白序列全部位于膜外區(qū)，不存在跨膜區(qū)。

2.5 IL-32 蛋白亞細(xì)胞定位 PSORTⅡ在線軟件的the k-NN Prediction 對(duì)IL-32 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，IL-32 定位于不同細(xì)胞器的可能性分別為：細(xì)胞質(zhì)（60.9%）、細(xì)胞核（17.4%）、線粒體（8.7%）、細(xì)胞骨架（8.7%）和高爾基體（4.3%）。

2.6 IL-32 蛋白翻譯后位點(diǎn)修飾 利用生物信息學(xué)在線軟件 NetNGlyc 1.0 Sever、NetOGlyc 4.0 Server、YinOYang1.2 Server 和 Netphos 2.0 Server 對(duì)IL-32 蛋白的翻譯后糖基化和磷酸化位點(diǎn)修飾進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。NetNGlyc 1.0 Sever 和 NetOGlyc 4.0 Server 預(yù)測(cè)結(jié)果表明IL-32 蛋白沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)，其O-糖基化位點(diǎn)分別在第34 位、第133 位、第211 位和第 228 位氨 基酸 ；YinOYang1.2 Server 對(duì)O-糖基化位點(diǎn)再次進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示有7 個(gè)位點(diǎn)，分別位于第 24 位、第 80 位、第 143 位、第 207位、第 228 位、第 232 位和第 233 位氨基酸。第 228位氨基酸被2 種軟件同時(shí)預(yù)測(cè)為O-糖基化位點(diǎn)。Netphos 2.0 Server 對(duì)IL-32 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，IL-32 蛋白有 14 個(gè) Ser、6 個(gè) Thr、2 個(gè)Tyr 可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

2.7 IL-32 蛋白相互作用分析 相互作用基因庫(kù)檢索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）能構(gòu)建已知蛋白質(zhì)與預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。它不僅包括直接的物理相互作用，還包括間接的功能相關(guān)，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的可能性進(jìn)行打分，評(píng)價(jià)相互作用可能性的大小。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，構(gòu)成IL-32 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的蛋白有10 個(gè)（圖4），分別為：PRTN3（score:0.984）、CXCL8（score:0.748）、IL18（score:0.722）、IL17A（score:0.713）、IL1B（score:0.702）、HGF（score: 0.658）、IL18RAP （score:0.653）、IDO1 （score:0.644）、DNAJA2（score:0.642）、TSLP（score:0.625）。

圖4 IL-32 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論

IL-32 基因位于人染色體16p13.3，含有8 個(gè)外顯子。蛋白質(zhì)前體由234 個(gè)氨基酸殘基組成，目前發(fā)現(xiàn)有9 個(gè)可變剪接體。IL-32 的表達(dá)主要在免疫細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)。

國(guó)內(nèi)、外研究表明，在IL-32 蛋白的9 種剪接體中，只有 IL-32γ 存在N 末端疏水信號(hào)肽，而其他剪接體沒(méi)有典型的信號(hào)肽［3］；從 IL-32 的分布來(lái)看，IL-32α 分布于細(xì)胞內(nèi)，而 IL-32β 是被分泌到細(xì)胞外［14］，也有研究顯示 IL-32β 分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在細(xì)胞核和質(zhì)膜中不存在［15］，在人T 細(xì)胞中 IL-32β 不被分泌［16］；IL-32 蛋白不存在跨膜區(qū)，但是也有研究指出IL-32 在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)與細(xì)胞膜有關(guān)聯(lián)［17］。由此可見(jiàn)，IL-32 蛋白的作用部位仍存在爭(zhēng)議［18］，還待進(jìn)一步研究。本研究顯示IL-32 蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不具有信號(hào)肽，既不是經(jīng)典型分泌蛋白，也不是非經(jīng)典型分泌蛋白，分布于細(xì)胞質(zhì)（60.9%）、細(xì)胞核（17.4%）、線粒體（8.7%）、細(xì)胞骨架（8.7%）和高爾基體（4.3%），屬于胞內(nèi)蛋白。這為 IL-32 蛋白性質(zhì)的研究添加了新的證據(jù)。

糖基化和磷酸化修飾是真核生物內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后廣泛存在的重要修飾方式，能調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過(guò)程，這種修飾的異常與疾病的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)［19-20］。本研究利用多種不同的在線生物信息學(xué)軟件，對(duì)IL-32 蛋白的糖基化預(yù)測(cè)結(jié)果表明，IL-32 蛋白不存在N-糖基化位點(diǎn)，但是存在有O-糖基化位點(diǎn)。雖然不同軟件的分析結(jié)果不完全一致，這可能是由于不同軟件的算法不一致導(dǎo)致的，但是第228 位氨基酸被共同預(yù)測(cè)為O-糖基化位點(diǎn)。在磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)中，有 14 個(gè) Ser、6 個(gè) Thr、2 個(gè) Tyr 被預(yù)測(cè)為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。這將為研究IL-32 蛋白在細(xì)胞生理活動(dòng)中的功能及機(jī)制提供參考依據(jù)。

生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等組成了生命過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，而蛋白質(zhì)是體現(xiàn)生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者。蛋白質(zhì)不是獨(dú)立地行使功能，而是由許多蛋白質(zhì)及其他分子形成蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)而實(shí)現(xiàn)的。分析蛋白的相互作用關(guān)系，對(duì)于了解蛋白質(zhì)的工作原理及了解蛋白之間的功能聯(lián)系都有重要意義。本研究進(jìn)行的IL-32 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)研究顯示，IL-32 蛋白與10 個(gè)蛋白具有相互作用的可能性，其中包括白介素家族的IL18、IL17A、IL1B 及IL18的受體輔助蛋白（IL18RAP），這與目前報(bào)道的關(guān)于IL-32 的功能主要與炎癥有關(guān)相一致。其次筆者從 HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Protein Atlas，https：//www.prot-einatlas.org／）查詢發(fā)現(xiàn)，在互作蛋白中PRTN3 和CXCL8 在骨髓中顯著高表達(dá)，提示IL-32可能與PRTN3 和CXCL8 蛋白相互作用，在骨髓相關(guān)疾病中發(fā)揮一定的作用；HGF 和IDO1 在胎盤(pán)中顯著高表達(dá)，提示IL-32 蛋白可能與HGF 和IDO1 相互作用，在人妊娠過(guò)程中發(fā)揮一定的功能，這為后續(xù)研究IL-32 蛋白在人妊娠過(guò)程中的功能提供了理論依據(jù)。

總之，本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)IL-32蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，為進(jìn)一步研究IL-32 蛋白在生命活動(dòng)中的作用機(jī)制研究提供了思路和依據(jù)。