張松柏，陳 磊，許 文，張 勛，徐 偉，林 羽

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

金線蓮（Anoectochilusroburghii（Wal1.） Lindl），又名金線蘭、金蠶、烏人參、金線入骨消等，是一種多年生蘭科草本植物［1］，主產(chǎn)地為福建。文獻(xiàn)報(bào)道多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸類(lèi)等是金線蓮主要化學(xué)成分［2］。其中金線蓮多糖是其主要藥理活性物質(zhì)，具有降血糖、抗氧化、抗肝損傷、增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤等藥用功效［3］，因此測(cè)定金線蓮多糖可以為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。苯酚硫酸法是測(cè)定多糖含量的經(jīng)典方法，但是其對(duì)顯色條件要求嚴(yán)格，操作要求高［4］。本文旨在優(yōu)化苯酚硫酸法，提高金線蓮多糖含量測(cè)定的靈敏度和可操作性。

1 材 料

1.1 儀器 UV-3200紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；AR224CN電子天平（美國(guó)奧豪斯儀器常州有限公司）；SC-04低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑 D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)食品藥品質(zhì)量檢定研究院，批號(hào)：110833-201506）；硫酸（廣東西隴化工有限公司，批號(hào)：180922）；苯酚（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：P815401）；超純水（實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.3 藥材 不同產(chǎn)地金線蓮樣品8批，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定為蘭科開(kāi)唇蘭屬的金線蓮（Anoectochilusroburghii（Wal1.） Lindl），樣品信息表見(jiàn)表1。

2 方 法

2.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥金線蓮全草粉末（60℃烘干、過(guò)60目篩）0.5 g，置于錐形瓶中；以料液比1∶20加水，60℃超聲提取 30 min，3 600 r／min離心15 min，取上清液置于錐形瓶中，重復(fù)3次；合并上清液，旋蒸至約20 mL，加入Sevage試劑，離心，重復(fù)3次合并上清液；上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，4℃過(guò)夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥48 h，得金線蓮粗多糖［5］。取粗多糖溶解，加水定容于1 000 mL的量瓶中，搖勻即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定D-葡萄糖50 mg溶于1 000 mL的量瓶中，加水定容，搖勻即得。

2.3 吸收波長(zhǎng)確定 精密吸取對(duì)照品與供試品溶液0.5 mL，置于具塞玻璃管中，加水補(bǔ)足至1 mL，混勻；加入5 mL硫酸，室溫放置60 min；加入4%苯酚1.2 mL，搖勻，50 ℃水浴 25 min，冰浴 5 min，室溫放置15 min。以水為空白，自“再加入5 mL硫酸”起，同法操作，作為空白對(duì)照。在紫外分光光度計(jì)下于300～800 nm掃描全波長(zhǎng)圖譜。

2.4 顯色條件的優(yōu)化 按照“2.3項(xiàng)”下的顯色條件，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別優(yōu)化各顯色條件：① 分別加入 4%苯 酚 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL；②分別加入硫酸 4、5、6、7、8、9 mL；③ 加入硫酸后放置時(shí)間分別 40、50、60、70、80 min；④ 水浴溫度分別為 30、40、50、60、70℃；⑤ 水浴時(shí)間分別為 15、25、35、45、55 min；⑥ 冰浴時(shí)間分別為 0、5、10、15、20 min。測(cè)定各顯色條件下490 nm最大吸收波長(zhǎng)處吸光度，確定最佳顯色條件。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于具塞玻璃管中，按“2.3項(xiàng)”下顯色方法進(jìn)行操作，490 nm測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.2 精密度考察 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于具塞試管中，按“2.3項(xiàng)”下顯色方法進(jìn)行操作，490 nm處連續(xù)測(cè)定5次，求算RSD值。

2.5.3 重復(fù)性考察 按“2.1項(xiàng)”制備5份供試品，分別精密量取5份供試品溶液各0.5 mL，置于具塞試管中，按“2.3項(xiàng)”顯色方法進(jìn)行操作，490 nm處測(cè)定吸光度，求算RSD值。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 取“2.5.3項(xiàng)”下的顯色溶液分別放置 5、15、25、35、45 min，并在 490 nm 處測(cè)定吸光度，求算RSD值。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取已知多糖含量的B1批金線蓮樣品約0.25 g共6份，加入葡萄糖對(duì)照品21.00 mg，按“2.1項(xiàng)”下供試品制備方法，制備得6份供試品；取上述供試品0.5 mL，按“2.3項(xiàng)”下顯色方法處理，測(cè)定吸光度，得總多糖回收率及RSD值。

3 結(jié)果與分析

3.1 吸收波長(zhǎng)的確定 按“2.3項(xiàng)”顯色方法操作，金線蓮供試品與葡萄糖對(duì)照品在490 nm處有最大吸收值，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。如圖1所示。

圖1 對(duì)照品和供試品在優(yōu)化方法顯色下的紫外吸收?qǐng)D譜

3.2 顯色條件優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 苯酚用量的確定 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3項(xiàng)”顯色方法加入 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 4%苯酚；同法每組以水為空白，加入不同體積苯酚，于490 nm測(cè)得吸光度。當(dāng)苯酚用量為1.2 mL的時(shí)候吸光度最大且穩(wěn)定，故選擇1.2 mL為苯酚用量。

3.2.2 濃硫酸用量的選擇 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3項(xiàng)”顯色方法加入 4、5、6、7、8、9 mL 的硫酸；同法每組以水為空白，加入不同體積硫酸，490 nm處測(cè)定吸光度。當(dāng)硫酸用量5 mL時(shí)，吸光度最大且穩(wěn)定，故選擇5 mL硫酸作為用量選擇。

3.2.3 加入硫酸后放置時(shí)間考察 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3 項(xiàng)”顯色方法加入硫酸后，放置 40、50、60、70、80 min；同法以水為空白，測(cè)定490 nm處吸光度。加入硫酸放置40～60 min樣品吸光度逐漸增加，60 min以后趨于穩(wěn)定，故選擇放置時(shí)間為60 min。

3.2.4 水浴溫度的選擇 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3項(xiàng)”下顯色方法加入4%的苯酚1.2 mL，分別置于30、40、50、60、70℃水浴，在490 nm下測(cè)定吸光度。 在水浴溫度為50℃時(shí)吸光度最大，故取50℃為最佳水浴溫度。

3.2.5 水浴時(shí)間的考察 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，加水補(bǔ)足至1 mL。按“2.3項(xiàng)”顯色方法加入4%的苯酚1.2 mL 以后，50 ℃水浴 15、25、35、45、55 min，490 nm測(cè)定吸光度。水浴25 min以后吸光度基本保持不變，故取25 min為最佳水浴時(shí)間。

3.2.6 冰浴時(shí)間的考察 精密吸取B1批的金線蓮供試品溶液0.5 mL置于具塞玻璃管中，按“2.3項(xiàng)”顯色方法處理，冰浴放置 0、5、10、15、20 min，490 nm處測(cè)定吸光度。冰浴5 min以后吸光度保持穩(wěn)定，考慮到節(jié)省時(shí)間，故選擇冰浴時(shí)間為5 min。

3.3 方法學(xué)考察結(jié)果 以葡萄糖用量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

該方法在10.12～50.58 μg葡萄糖用量范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度考察中RSD為0.22%，說(shuō)明儀器精密度良好；供試品重復(fù)性試驗(yàn)RSD為3.02%，說(shuō)明重復(fù)性良好；顯色溶液放置45 min內(nèi)RSD為0.14%，樣品穩(wěn)定性良好。平均回收率97.10%，RSD為1.24%，加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.4 金線蓮樣品多糖含量測(cè)定 各批次金線蓮藥材按“2.1項(xiàng)”處理，精密量取供試品溶液0.5 mL置于具塞試管中，加水補(bǔ)至1 mL，以水為空白，按“2.3項(xiàng)”下顯色方法，在490 nm處測(cè)定8批樣品吸光度，計(jì)算樣品多糖含量：A1、A2為5.16%、4.65%，B1、B2 為 8.69%、10.13%，S1、S2 為 5.45%、5.13%，樣品 T1、T2為 4.91%、6.17%。

4 討 論

苯酚硫酸法測(cè)定多糖的機(jī)制為多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖并迅速脫水，生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再進(jìn)一步與苯酚結(jié)合，生成有色化合物，該化合物在300～800 nm的紫外波段有特征吸收［6］，故可在紫外分光光度計(jì)下對(duì)其進(jìn)行定量分析。因過(guò)量硫酸可能造成紫外負(fù)吸收，苯酚與硫酸同時(shí)也會(huì)發(fā)生磺化反應(yīng)，苯酚用量的微小變化對(duì)吸光度影響較大［7］，同時(shí)顯色條件需要嚴(yán)格控制，所以對(duì)苯酚硫酸法進(jìn)行了優(yōu)化。

本文通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)的苯酚硫酸法進(jìn)行優(yōu)化，改變了硫酸與苯酚加入順序，使硫酸與多糖充分反應(yīng)生成糠醛化合物［6-7］，糠醛化合物再與苯酚結(jié)合，使硫酸與苯酚結(jié)合對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再產(chǎn)生干擾，同時(shí)考察了硫酸和苯酚用量等顯色條件。金線蓮藥材多糖含量測(cè)定使用優(yōu)化的苯酚硫酸法，能取得較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。該方法可操作性高，靈敏度高，且加樣回收率較高，故此法可用于金線蓮藥材中多糖含量的測(cè)定，為金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。測(cè)定的8批金線蓮，多糖含量在4.00%～11.00%，含量差異較大，可能與產(chǎn)地、栽培方式和栽培周期有關(guān)。日后將進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，探討多糖含量產(chǎn)生差異的相關(guān)研究。