沈 明 ，黃小強 ，阮美江

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院東二環(huán)分院，福建 福州 350011）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是以胃腸功能障礙為特征的嚴(yán)重疾病［1-2］，其主要特點是有腹痛、腹脹、食欲不振、早飽、嘔吐以及惡心等不適癥狀，在臨床上表現(xiàn)為胃排空和腸推進減慢，部分表現(xiàn)為胃液排空延遲［3］，但缺乏器質(zhì)性病變［4］，其發(fā)病機制目前尚未闡明。雞內(nèi)金性甘、平，歸脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)，具有健胃消食功效［5］。研究報道雞內(nèi)金具有增加小腸推進率的作用［6］。故本研究采用功能性消化不良模型大鼠，探討雞內(nèi)金對功能性消化不良大鼠模型大鼠胃腸功能的改善作用。

1 材 料

1.1 儀器 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Infinite公司）；高速臺式冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；垂直電泳槽、多功能成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）

1.2 藥品與試劑 雞內(nèi)金［同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，批號：001006133］；多潘立酮（西安楊森制藥有限公司，批號：180345630）；水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z03D6Y7011）；胃動素（MOT）和胃泌素（GAS）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（上海西塘生物科技有限公司，批號：1804081、1809071）；一抗水通道蛋白 4（AQP4）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、β-肌動蛋白（β-actin）、二抗羊抗鼠和羊抗兔（美國CST公司，批號分別為：59678、5880、3700、14709、14708）；RIPA 裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒和ECL發(fā)光劑（上海碧云天生物科技有限公司，批號分別為：P0013B、ST506、P0690、P0012、P0018FS）。

1.3 動物 60只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購自上海史萊克實驗動物中心，生產(chǎn)使用合格證：SCXK（滬）2018-0006，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房，溫度21～23℃，相對濕度55%～75%，12 h晝夜循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 雞內(nèi)金水提物的制備 取雞內(nèi)金藥材100 g，放置圓底燒瓶中，然后加入8倍量蒸餾水，浸泡30 min后，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮20 min，抽濾；濾渣再加6倍量蒸餾水，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮20 min，抽濾；合并2次濾液，60℃下減壓濃縮至0.4 g／mL適量，備用。

2.1.2 多潘立酮溶液的制備 將多潘立酮研成細(xì)粉末，溶于水中，制備成質(zhì)量濃度0.000 4 g／mL的溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥 將60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組，模型組，多潘立酮組［0.004／（kg·d）］，雞內(nèi)金低、中、高劑量組［生藥材1、2、4／（kg·d）］，每組 10 只。 正常組大鼠灌胃給予常溫生理鹽水，其余各組大鼠給予0℃ 0.5 mol／L稀鹽酸（劑量1 mL／100 g體質(zhì)量）誘導(dǎo)功能性消化不良模型［7］。 連續(xù)造模 14 d 后，按照 1 mL／100 g 體質(zhì)量灌胃給藥，正常組、模型組大鼠給予常溫生理鹽水，其余各組大鼠給予相應(yīng)濃度藥物，每天灌胃給藥1次。連續(xù)給藥7 d后采用10%水合氯醛（0.35 mL／100 g體質(zhì)量）麻醉腹主動脈取血后處死，檢查各組大鼠胃排空和腸推進功能，并取胃組織液氮速凍后，保存于－80℃低溫冰箱，備用。

2.3 大鼠胃排空和小腸推進功能測定 大鼠禁食不禁水12 h后，給予半流質(zhì)飼料和碳粉混合物，2 g／只，第 30 min給予水合氯醛 0.3 mL／100 g腹腔注射麻醉，大鼠腹主動脈取血處死；然后取胃組織在洗凈前后分別稱定質(zhì)量，并計算胃內(nèi)殘渣量（胃內(nèi)殘渣量＝胃總質(zhì)量-胃凈質(zhì)量），以評價大鼠胃排空功能；取小腸平鋪，測量半流體飼料和碳粉混合物從胃幽門括約肌推動到回盲腸的距離，并計算小腸推進率（小腸推進率＝幽門至碳末前沿的長度／幽門至盲腸長度×100%）。

2.4 大鼠血清中GAS和MOT測定 取血后離心3 000 r／min，10 min，取上清，按照試劑盒說明書步驟，用ELISA法測定大鼠血清中GAS和MOT含量。

2.5 大鼠胃組織中AQP4和eNOS蛋白表達檢測取胃組織，采用液氮研磨法，以1∶10比例（0.1 g組織∶1 mL 裂解液），12 000 r／min 離心 10 min， 取上清液，用BCA試劑盒進行蛋白定量，制備樣品；采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗，其中內(nèi)參 1∶5 000，其他抗體 1∶1 000，過夜，TBST 沖洗 3 次，加入二抗 1∶5 000，TBST沖洗3次，ECL發(fā)光液顯影。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行分析處理。計量資料符合正態(tài)分布的以（）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 6組大鼠胃排空功能的影響 見表1。

表1 6組大鼠胃排空功能的影響（）

表1 6組大鼠胃排空功能的影響（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別正常組模型組多潘立酮組雞內(nèi)金低劑量組雞內(nèi)金中劑量組雞內(nèi)金高劑量組n 10 10 10 10 10 10胃內(nèi)殘渣量／g 0.83±0.15 1.70±0.121）1.27±0.142）1.67±0.11 1.56±0.13 1.47±0.143）

3.2 6組大鼠小腸推進功能的影響 見表2。

3.3 6組大鼠血清中GAS和MOT的影響 見表3。

表2 6組大鼠小腸推進功能的影響（）

表2 6組大鼠小腸推進功能的影響（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組多潘立酮組雞內(nèi)金低劑量組雞內(nèi)金中劑量組雞內(nèi)金高劑量組n 10 10 10 10 10 10小腸推進率／%67.05±7.61 43.87±5.701）61.42±4.702）46.55±6.18 51.85±5.192）56.16±5.192）

表3 6組大鼠血清中GAS和MOT的影響（）pg／mL

表3 6組大鼠血清中GAS和MOT的影響（）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正常組模型組多潘立酮組雞內(nèi)金低劑量組雞內(nèi)金中劑量組雞內(nèi)金高劑量組n 10 10 10 10 10 10 GAS 188.41±20.71 109.85±14.301）152.52±23.402）116.95±12.85 128.65±15.823）142.76±16.102）MOT 107.69±14.34 58.57±8.581）80.21±8.742）61.90±6.01 69.18±8.473）77.42±11.072）

3.4 6組大鼠胃組織中AQP4和eNOS蛋白表達的影響 見圖1和表4。

圖1 6組大鼠胃組織中AQP4和eNOS蛋白表達

表4 6組大鼠胃組織中AQP4和eNOS 蛋白表達的影響（）

表4 6組大鼠胃組織中AQP4和eNOS 蛋白表達的影響（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正常組模型組多潘立酮組雞內(nèi)金低劑量組雞內(nèi)金中劑量組雞內(nèi)金高劑量組n 10 10 10 10 10 10 AQP4／β-actin 1.00±0.18 0.68±0.141）0.86±0.182）0.76±0.18 0.89±0.172）0.92±0.233）eNOS／β-actin 1.00±0.26 1.89±0.431）1.16±0.353）1.47±0.452）1.21±0.313）0.91±0.233）

4 討 論

據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)FD的發(fā)病率約為10%～30%［8］，其發(fā)病因素與腦腸軸失衡、胃腸運動功能障礙、內(nèi)臟過敏、慢性炎癥、幽門螺桿菌感染、精神和心理因素有關(guān)［9-10］，其中胃腸運動功能障礙是FD的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)高達50%以上的FD患者都存在胃腸動力障礙［11］，因此胃腸動力障礙在FD發(fā)生中起著重要作用，提示增加胃動力藥物成為FD的主要治療方案之一。GAS主要由胃竇G細(xì)胞分泌，可刺激胃酸的分泌，調(diào)節(jié)胃腸運動功能，是一種可興奮胃腸運動的腦腸肽［12］。MOT是一種促進和影響胃腸蠕動及胃腸道對水、電解質(zhì)運輸?shù)南兰に?，可以直接促進胃腸的肌纖維收縮，防止內(nèi)容物反流［13］，提示GAS和MOT在治療FD患者中發(fā)揮重要作用。

AQP4蛋白廣泛分布于胃組織細(xì)胞中，對胃酸分泌、水分轉(zhuǎn)運和滲透壓調(diào)節(jié)起到重要作用［14］。內(nèi)皮型eNOS以L-精氨酸為底物合成NO，NO具有調(diào)節(jié)血管、抑制血小板凝聚、保護內(nèi)皮細(xì)胞等作用［15］。曹峰等［16］在茯苓甘草湯對功能性消化不良大鼠的調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)功能性消化不良的改善與胃組織中AQP4和eNOS蛋白表達有關(guān)，說明FD發(fā)病與AQP4和eNOS表達有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：雞內(nèi)金可以增強FD模型大鼠胃排空和小腸推進率，提高血清中GAS和MOT水平，上調(diào)胃組織中AQP4蛋白表達和降低胃組織中eNOS表達水平，從而改善FD模型大鼠胃腸功能。