于 娟，陳啟蘭，陳 玨

（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000）

雙孢蘑菇珍華片是由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司開發(fā)的保健食品，具有增強免疫力、保護化學(xué)性肝損傷的作用。其原料雙孢蘑菇［1-2］是目前世界上栽培最廣泛、產(chǎn)量最多的一種食用菌，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素等，營養(yǎng)豐富，具有較高的醫(yī)療保健價值，能夠提高機體免疫功能，調(diào)節(jié)血液中葡萄糖和膽固醇的平衡，具有抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛消炎、抑菌、保肝等作用。但有研究發(fā)現(xiàn)：食用菌除維持自身生長發(fā)育所必需的元素外，對部分重金屬如砷等也具有富集作用。鄭偉華等［3］測定了多種食用菌中的砷，檢出率為100%。砷經(jīng)食用菌富集后，通過食物鏈進入人體，對人體健康構(gòu)成較大威脅。砷作為公認(rèn)的有毒物質(zhì)，作用于機體可引起急、慢性中毒，還具有致癌性、生殖毒性、發(fā)育毒性，其含量向來是各國法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)注重點。目前國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)以砷總量控制為主，但是僅以總砷含量評價砷攝入風(fēng)險是不夠科學(xué)的。研究表明：不同的砷形態(tài)具有不同的理化性質(zhì)，特別是其毒性取決于其存在的化學(xué)形態(tài)。無機砷劇毒，隨化合價的不同毒性不同，而砷的有機化合物毒性通常比無機砷小。6種主要砷形態(tài)化合物亞砷酸［三價砷As（Ⅲ）］、砷酸［五價砷As（Ⅴ）］、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷膽堿（AsC）和砷甜菜堿（AsB）對實驗小鼠的半數(shù)致死量（LD50）依次為 14、20、200～1 800、200～2 600、＞6 500、＞10 000 mg／kg［4］，由此可見，不同砷形態(tài)之間毒性差異很大，要準(zhǔn)確評估食用菌中砷攝入風(fēng)險，應(yīng) 進 行 砷 形 態(tài) 分 析［5-6］。

本研究以雙孢蘑菇鮮品和雙孢蘑菇提取物為研究對象，建立高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）測定 6種不同形態(tài)砷［As（Ⅲ）、As（V）、MMA、DMA、AsC、AsB］的方法，優(yōu)化并確定樣品前處理方法，進行方法學(xué)考察。雙孢蘑菇鮮品及其提取物中砷形態(tài)化合物分析方法的建立，有助于掌握雙孢蘑菇中砷形態(tài)分布規(guī)律，對于雙孢蘑菇及其制品的質(zhì)量安全性評估和砷化合物人工控制具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent 7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；CR21N型高速離心機（日本日立公司）；XS204電子天平、S40酸度計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA MS3渦旋混合器（艾卡儀器設(shè)備有限公司）；Multiwave 3000微波消解系統(tǒng)（安東帕有限公司）；BHW-09A Digestor恒溫消解儀（上海博通化學(xué)科技有限公司）；移液槍（吉爾森科技有限公司）。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑 碳酸銨（色譜純，美國 Fluka公司）；硝酸（優(yōu)級純，美國Thermo Fisher公司）；氨水（28%～30%，美國Acros Organics公司）；磷酸二氫鉀（純度＞99%，美國 Acros Organics公司）；胰酶（美國Sigma公司）；磷酸（色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（優(yōu)級純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。除非另有說明，本實驗所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規(guī)定的一級水。

亞砷酸［三價砷 As（Ⅲ）］、砷酸［五價砷 As（V）］標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為 1 000 μg／mL，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；砷膽堿（AsC，GBW08671）、砷甜菜堿（AsB，GBW08670）、二甲基砷（DMA，GBW 08669）和一甲基砷（MMA，GBW08668）標(biāo)準(zhǔn)溶液：均購自中國計量科學(xué)研究院；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為1 000 μg／mL，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。6種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備：用水將各種砷形態(tài)稀釋成濃度均為1 μg／mL的標(biāo)液，儲存于4℃冰箱中。砷標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液使用時現(xiàn)配。

1.2.2 材料 50 mL塑料高速離心管；10 mL塑料刻度離心管；水系微孔濾膜（0.22 μm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理

2.1.1 雙孢蘑菇提取物 混勻后裝入潔凈的聚乙烯自封袋中，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 雙孢蘑菇鮮品 取樣品約500 g，將其可食部分先切碎，經(jīng)均質(zhì)器充分?jǐn)囁榫鶆?，制得試樣裝入潔凈的聚乙烯自封袋中，密封置于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 人工腸液制備 取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，即得。

2.3 樣品提取 取雙孢蘑菇樣品1.0 g，精密稱定，置50 mL塑料高速離心管中，精密加入人工腸液20 mL后于37℃水浴中超聲萃取30 min；搖勻，在15 000 r／min條件下離心 10 min；精密量取5 mL上清液于10 mL的刻度離心管中，加水定至10 mL，混勻后過0.22 μm水系微孔濾膜，待測。同法制備空白溶液。

2.4 儀器條件

2.4.1 HPLC測定條件 色譜柱：Hamilton PRP X-100 陰離子分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；PRP X-100保護柱。流動相A為0.03 mol／L硝酸銨+0.03 mol／L 磷酸氫二銨（pH：9.0±0.05），流動相 B為 0.001 mol／L 碳酸銨，流速 1.0 mL／min，進樣量50 μL，按表 1進行梯度洗脫，運行時間 11 min，柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 ICP-MS測定條件 功率：1 500 W；高純氬氣為載氣；泵速 20 r／min；駐留時間：1 000 ms；采集質(zhì)量數(shù)m／z＝75；采集模式：標(biāo)準(zhǔn)模式；調(diào)諧：讓儀器達到最佳狀態(tài)。

2.5 測定 待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，測定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液和樣品待測液。圖1為6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的色譜圖。

圖1 6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及雙孢蘑菇樣品（B）的色譜圖

2.6 檢出限、定量限與線性關(guān)系考察 以不低于3倍信噪比（S／N≥3）確定方法檢出限（LOD），以 S／N＝10時所對應(yīng)的濃度作為定量限（LOQ），結(jié)果如表 2 所示，6種砷形態(tài)的 LOD 為 0.23～0.68 μg／L，LOQ 為 0.75～2.28 μg／L。6種砷形態(tài)化合物線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。將6種砷形態(tài)混合標(biāo)液按照濃度從低至高依次進樣，結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)，6種砷形態(tài)化合物的峰面積與濃度均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.999。

表2 6種砷形態(tài)的檢出限、定量限、線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)（r）

2.7 精密度實驗 按照“2.4”項下分析條件，將50 μg／L的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果6種砷形態(tài)峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 回收率實驗 對雙孢蘑菇鮮品及提取物進行回收率實驗，各做3個水平的加樣回收，每個水平3個平行，測定并計算回收率，結(jié)果見表3、表4。平均回收率為82.7%～107%，RSD為1.76%～7.78%。

表3 雙孢蘑菇鮮品中6種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率

表4 雙孢蘑菇提取物中6種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率

2.9 雙孢蘑菇鮮品及提取物實際樣品檢測 選購市售雙孢蘑菇鮮品及提取物，采用上述建立的HPLC-ICP-MS方法測定6種砷形態(tài)，同時采用《食品中總砷及無機砷的測定》［7］中第一篇第一法——電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定總砷含量，結(jié)果見表5。表5顯示：雙孢蘑菇鮮品及提取物中均有6種砷形態(tài)檢出，砷形態(tài)的總量與ICP-MS測得總砷含量相當(dāng)，雙孢蘑菇中的砷主要以AsB的形式存在，占總量62.4%～82.9%。與雙孢蘑菇鮮品相比，提取物的砷總量降低，主要體現(xiàn)在AsB含量降低。

3 討 論

3.1 流動相的選擇 根據(jù)文獻資料，砷形態(tài)分析常用流動相有碳酸銨、磷酸氫二銨、乙酸鈉+硝酸鉀+磷酸二氫鈉+EDTA+無水乙醇［7-12］等，但是非揮發(fā)性緩沖鹽溶液易聚集在透鏡和采樣錐上，從而導(dǎo)致信號不穩(wěn)定和“記憶”效應(yīng)，有機溶劑在ICP中產(chǎn)生的碳也可造成進樣管和采樣錐、截取錐兩錐孔的變小甚至堵塞，影響信號穩(wěn)定性［13］。碳酸銨因其殘留少且長時間使用也無信號漂移成為砷形態(tài)分析流動相首選，但實驗中發(fā)現(xiàn)，僅以碳酸銨溶液作為流動相時，AsC和AsB無法分開，結(jié)合文獻，并考慮到銨鹽對采樣錐和截取錐的損傷更小，本實驗以碳酸銨溶液和磷酸氫二銨溶液為流動相，同時加入硝酸銨以消除氯離子的干擾。經(jīng)優(yōu)化，最終確定0.03 mol／L 硝酸銨+0.03 mol／L 磷酸氫二銨（pH：9.0±0.05）為流動相 A，0.001 mol／L 碳酸銨為流動相B，梯度洗脫。

表5 實際樣品檢測結(jié)果mg／kg

3.2 提取方法的選擇 超聲提取利用高頻機械振動最大限度地使樣品分散在提取溶劑中，保證了提取過程中各種砷形態(tài)的有效溶出且無交叉污染。以雙孢蘑菇提取物為實驗樣品，以提取效率為考察參數(shù)，對超聲提取和熱浸提兩種方法進行比較。結(jié)果顯示：超聲提取測得6種砷形態(tài)總量高于熱浸提，與熱浸提相比，超聲提取還具有提取時間短、提取溫度低、操作簡單等優(yōu)點。綜合考慮，確定采用超聲萃取作為樣品前處理方式。按照“2.3”項下樣品前處理方法，考察不同超聲時間對提取結(jié)果的影響。超聲時間為20 min時，測得各種砷形態(tài)含量明顯偏低，提取不完全；超聲時間為30、40 min時樣品中可檢出的各種砷形態(tài)含量無明顯差異，故選擇超聲時間為30 min。

3.3 提取溶劑的選擇 砷形態(tài)分析常用提取溶劑有水、水-甲醇、酸等，為減少有機溶劑的引入，排除含有甲醇的提取溶劑。另根據(jù)文獻資料［14-15］，在人工腸液中砷的溶出量大于水中，故本實驗對人工腸液和硝酸、乙酸進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以硝酸為提取溶劑，砷形態(tài)的保留時間會產(chǎn)生偏移，且硝酸容易氧化低價的砷，使得砷的化學(xué)形態(tài)發(fā)生變化，影響測定效果；而用乙酸提取，提取率明顯偏低，As（V）尤為明顯，測得量只有人工腸液提取所得As（V）的20%，故選擇人工腸液為提取溶劑進行超聲萃取。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性考察 為考察標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，將配制好的50 μg／L砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液密封、避光、0～4℃保存48 h后與新配制的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行比較，發(fā)現(xiàn)除DMA峰面積無明顯變化外，其余5種砷形態(tài)化合物峰面積均有不同程度的變化，以降低為主，其中As（V）基本上轉(zhuǎn)變成毒性更大的 As（Ⅲ），標(biāo)準(zhǔn)工作液需用時新配［4］。

本實驗建立了HPLC-ICP-MS同時測定雙孢蘑菇珍華片原料雙孢蘑菇中 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（V）等6種砷形態(tài)化合物的分析方法，確定最佳提取方法為以人工腸液水浴超聲30 min提取。該方法線性范圍寬、檢出限低、重復(fù)性好、檢測速度快，并通過加標(biāo)回收實驗驗證了其適用性、準(zhǔn)確性，適用于雙孢蘑菇中砷形態(tài)的分析檢測，有助于了解雙孢蘑菇中砷形態(tài)的分布，可為雙孢蘑菇及其精深加工產(chǎn)品的安全性評價提供一定的依據(jù)。