梁珊珊 ，劉銘珍 ，賴思羽 ，向 青 ，張小琴

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)技術(shù)工程研究中心，福建 福州 350122）

研究發(fā)現(xiàn)胰島B細(xì)胞分泌功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病的核心機(jī)制［1］。其中胰島素抵抗就是一種低度的炎癥狀態(tài)，而炎癥又會(huì)導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能逐漸衰竭［2-3］。已有研究表明Toll樣受體4（TLR4）可誘導(dǎo)參與炎癥反應(yīng)的多種基因表達(dá)，血紅素氧合酶－1（HO-1）具有明顯的抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用［4-5］。

大黃素（emodin）是蓼科植物大黃的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制細(xì)胞增殖、提高免疫等多種藥理作用［6］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：大黃素能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和空腹胰島素等，顯示出能夠增強(qiáng)胰島素敏感性的作用［7］。本研究旨在觀察大黃素對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的胰島INS-1 細(xì)胞模型中白介素-6（IL-6）、TLR4、HO-1 的影響，探討大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的胰島INS-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 胰島B細(xì)胞株INS-1購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑 大黃素（大連美侖生物有限公司，批號(hào)：J0616A，純度＞97%）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（美國(guó)Gibco公司）；LPS（美國(guó)Sigma公司）；IL－6 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液、PMSF、5X蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TLR4抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；HO-1抗體（英國(guó) Abcam公司）；β-actin抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胰島INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素及 50 μmol／L巰基乙醇的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代。

2.2 模型建立及藥物處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞以3×105細(xì)胞／孔接種于6孔板，正常培養(yǎng)24 h后分為空白組、模型組及大黃素組?？瞻捉M不做任何處理，模型組以20 mg／L LPS作用于INS-1細(xì)胞，大黃素組以 20 mg／L LPS+0.1 μmol／L 大黃素作用于INS-1細(xì)胞。藥物刺激12 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)差異，收集上清用于IL-6檢測(cè)，收集細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)。

2.3 ELISA法檢測(cè)IL-6表達(dá)水平 取出-80℃保存的細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)IL-6含量。以100 μL／孔加入酶標(biāo)板，37℃下孵育1.5 h；取出拍干，加入稀釋后的抗體工作液100 μL／孔，37℃下孵育1 h；拍干，加入經(jīng)稀釋的洗液300 μL／孔，浸泡 1 min后拍干，重復(fù) 3次；以 100 μL／孔加入已稀釋并經(jīng)37℃平衡30 min的ABC工作液，37℃下作用30 min；取出重復(fù)上述洗液步驟5次，加入平衡30 min的TMB顯色液90 μL／孔，37℃反應(yīng)15～20 min，最后加入TMB終止液，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含量。

2.4 Western blot法檢測(cè)TLR4、HO-1蛋白表達(dá)將去除培養(yǎng)基后收集的細(xì)胞培養(yǎng)板，加入細(xì)胞裂解液（含PMSF），提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液（5×）4∶1混合，100℃變性 10 min；取 30 μg蛋白樣品上樣，SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，一抗 TLR4（1∶500）、HO-1（1∶250） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，每次 10 min；二抗（1∶3 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，每次10 min。采用ECL發(fā)光試劑顯色，并經(jīng)ImageJ凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影檢測(cè)，分析目標(biāo)條帶TLR4、HO-1及內(nèi)參β-actin的灰度值，計(jì)算出目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值，對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間的兩兩比較，方差齊時(shí)用LSD－t方法，不齊時(shí)用 Games-Howell方法；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大黃素對(duì)INS-1細(xì)胞形態(tài)的影響 見圖1。

圖1 大黃素對(duì)3組INS-1細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

3.2 大黃素對(duì)3組INS-1細(xì)胞IL-6的影響 見圖2。

圖2 大黃素對(duì)INS-1細(xì)胞IL-6的影響

3.3 大黃素對(duì) 3組INS-1細(xì)胞蛋白 TLR4、HO-1表達(dá)的影響 見圖3。

4 討 論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝疾病，其中胰島B細(xì)胞功能低下導(dǎo)致的糖尿病為2型糖尿病。引起血糖升高的病理機(jī)制主要是漸進(jìn)性胰島B細(xì)胞的功能衰竭和胰島素抵抗。越來越多的研究表明，在2型糖尿病患者胰島也出現(xiàn)以巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加為主要特征的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能缺陷［8-10］。眾多的細(xì)胞因子和趨化因子參與了2型糖尿病胰島炎癥反應(yīng)的過程。HO-1是血紅素降解的起始酶和限速酶，具有強(qiáng)大的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作用。TLR4識(shí)別功能可激活NF-κB，進(jìn)而導(dǎo)致一系列炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［11］。

圖3 大黃素對(duì)3組INS-1細(xì)胞TLR4、HO-1蛋白表達(dá)的影響

大量研究顯示：大黃素能夠抑制炎癥，提高胰島素敏感性，增加外周葡萄糖攝取。離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)：大黃素能夠通過激活PI3K／PKB信號(hào)途徑，減少NF-κB p50亞基向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而抑制LPS誘導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［12］；通過抑制 NF-κB活性和MAPK通路，抑制經(jīng)佛波醇和鈣離子通道劑A23187 刺激的肥大細(xì)胞分泌 TNF-α 和 IL-6［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)LPS刺激的INS-1細(xì)胞，IL-6的釋放量顯著增加，TLR4蛋白水平升高，HO-1蛋白表達(dá)下降；而大黃素能顯著降低IL-6的釋放，抑制TLR4水平的升高以及HO-1水平的下降。說明大黃素能減輕LPS誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的炎癥損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控IL-6水平及TLR4和HO-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。