鄢春錦 ，廖凌虹 ，陳繼承 ，丁珊珊 ，高碧珍 ，

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3.中醫(yī)證研究福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；4.泉州市中醫(yī)院，福建 泉州 362000）

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，能分解脂蛋白中的三酰甘油［1-2］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的LPL基因的敲除將導(dǎo)致其內(nèi)臟脂肪含量明顯上升，體質(zhì)量顯著升高，脂質(zhì)將沉積在靶組織［2］，因此，LPL表達(dá)的異常將影響機(jī)體的脂質(zhì)代謝。二陳湯是中醫(yī)四大方證之一，主要功效是燥濕化痰、理氣和中，用于治療各種痰證，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)脂類代謝方面作用顯著［3-4］，但機(jī)制不明確。我們以肥胖大鼠為模型，觀察二陳湯對(duì)大鼠LPLmRNA和LPL蛋白表達(dá)的影響，以期初步闡明其可能的分子機(jī)制。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量平均為（200±20）g，3月齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：2011000521084，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境。

1.2 藥物與試劑 二陳湯各藥物購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂；二甲雙胍（齊魯制藥有限公司，25 mg／片，批號(hào)：3090021KC）；Trizol Reagent（美國(guó) Invitrogen 公 司 ）；PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Pre mix Ex TaqTM（TliRnaseH Plus）購(gòu)自大連 TaKaRa公司；β-actin抗體（美國(guó) Sigma公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG、Western blot相關(guān)試劑盒（杭州碧云天生物技術(shù)有限公司）；LPL單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）。

1.3 主要儀器 定量PCR儀（Epgradient型，德國(guó)Eppendorf公司）；化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)（Chemidocxrs+型，美國(guó)Bio-Rad公司）；蛋白轉(zhuǎn)移儀（Miniproteam 3型，美國(guó)Bio-Rad公司）；全自動(dòng)生化分析儀（7180型，日本日立公司）。

2 方 法

2.1 藥物的制備 用天平稱取茯苓9 g，橘紅15 g，半夏15 g，甘草4.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水浸泡30 min，文火水煎兩次，混合兩次水煎液后用紗布過(guò)濾，再將濾液濃縮至0.435 g／mL濃度，高壓滅菌后4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩６纂p胍25 mg，溶于無(wú)菌蒸餾水中，配成10 mg／mL溶液。

2.2 動(dòng)物分組和給藥方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組10只和造模組35只。正常組由普通飼料喂養(yǎng)，造模組由高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料由l%膽固醇、20%豬油、2%奶粉、4%白糖和73%普通飼料組成。喂養(yǎng)10周后，取造模組內(nèi)體質(zhì)量超過(guò)正常組大鼠體質(zhì)量均值加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差的大鼠，其平均體質(zhì)量（444.8±31.8）g與正常組（384.0±18.0）g相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），判斷造模成功［5］。成功制備肥胖模型大鼠30只，其余5只大鼠體質(zhì)量未達(dá)標(biāo)，將其舍棄。再將30只成模大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為二陳湯組、二甲雙胍組和模型組各 10只。二陳湯組按 4.35 g／（kg·d）劑量灌服二陳湯，二甲雙胍組則按 100 mg／（kg·d）灌服二甲雙胍，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。藥物干預(yù)期間，正常組給予普通飼料，其他組給予高脂飼料，干預(yù)4周。

2.3 標(biāo)本采集 末次灌胃后10 h（禁食不禁水），用20%烏拉坦腹腔注射麻醉（劑量為1 g／kg），腹主動(dòng)脈采血制備血清，-80℃保存。取腎周脂肪組織200 mg，離體后馬上置液氮壺內(nèi)，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 血清脂質(zhì)水平檢測(cè) 采用日立7180自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂肪組織LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平 各組隨機(jī)選取5份脂肪組織，采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)A260和A280比值，并計(jì)算RNA濃度，甲醛變性電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行鑒定。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因，目的基因和β-actin引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（LPL上游：5'-AACAT TGGAGAAGCCATTCG-3'，下游：5'-TTCATTCAGC AGGGAGTCAA-3'；β-actin 上游：5'-TGAGACCTTC AACACCCCAG-3'，下游：5'-GCCATCTCTTGCTCG AAGTC-3'）。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30 s，94℃變性 5 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，共 40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法分析大鼠LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平，以 β-actin基因作為內(nèi)參，利用 2-△△Ct法計(jì)算各組LPLmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4.3 Western印跡法檢測(cè)脂肪組織LPL蛋白表達(dá)各組隨機(jī)選取5份脂肪組織進(jìn)行檢測(cè)。將樣品置于勻漿器中，加入700 μL單去污劑裂解液（含PMSF）進(jìn)行勻漿，裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白質(zhì)。配制10%分離膠、4%的濃縮膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于孵育袋中加入一抗，4℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，洗膜后加二抗，37℃搖床孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，ImageJ凝膠圖象軟件分析光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 4組大鼠血清脂質(zhì)水平比較 見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠血清脂質(zhì)水平比較（）mmol／L

表1 4組大鼠血清脂質(zhì)水平比較（）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與二甲雙胍組比較，3） P＜0.05。

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 TC 1.40±0.11 2.00±0.091）1.82±0.133）1.50±0.232）TG 0.79±0.11 1.04±0.091）0.75±0.102）0.87±0.162）HDL-C 1.17±0.16 1.13±0.10 1.04±0.05 1.13±0.12 LDL-C 0.21±0.04 0.28±0.031）0.21±0.032）3）0.26±0.06

3.2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

表2 4組大鼠脂肪組織LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 LPLmRNA相對(duì)表達(dá)量0.9994±0.1761 1.0205±0.0417 1.1503±0.1780 1.0557±0.1076

3.3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3、圖 1。

4 討 論

超重和肥胖是多種常見(jiàn)慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素，研究肥胖的發(fā)病機(jī)制，建立有效的預(yù)防和治療措施是目前急需解決的問(wèn)題。“肥人多痰”是中醫(yī)的經(jīng)典理論，廖凌虹等［6］研究也發(fā)現(xiàn)痰是肥胖的重要中醫(yī)病理因素，從痰辨證論治，可作為治療肥胖及其誘發(fā)的多種代謝疾病的重要手段。

表3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達(dá)比較（）

表3 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達(dá)比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組二陳湯組二甲雙胍組n 10 10 10 10 LPL相對(duì)表達(dá)量1.2206±0.0317 1.5188±0.06031）1.7256±0.11242）1.7195±0.19112）

圖1 4組大鼠脂肪組織LPL蛋白表達(dá)比較

本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食誘導(dǎo)，制備肥胖大鼠模型。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肥胖動(dòng)物模型的鑒定缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為正常組與造模組的體質(zhì)量有顯著性差異，即可判斷造模組出現(xiàn)肥胖。本實(shí)驗(yàn)成模大鼠體質(zhì)量超過(guò)正常組大鼠均值加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間差異顯著，判斷造模成功。通過(guò)血清生化分析，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠TC、TG和LDL-C水平比正常組明顯升高。在繼續(xù)給予高脂飲食的同時(shí)，我們用二陳湯對(duì)肥胖大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)4周，發(fā)現(xiàn)大鼠血清TG和LDL-C水平顯著下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二陳湯能在不控制飲食的情況下，降低大鼠的血脂水平，說(shuō)明二陳湯可以應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)性肥胖伴脂代謝紊亂的治療。而經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后，則是TC和TG水平比模型組明顯降低，說(shuō)明兩種藥物的作用側(cè)重點(diǎn)有所不同，但對(duì)于糾正脂質(zhì)代謝異常都有積極的意義。

LPL是脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶［7］，主要在脂肪組織和骨骼肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成［8］，隨后要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)加工，其活性和濃度是影響機(jī)體血脂濃度的關(guān)鍵因素。由于肥胖人群普遍存在脂質(zhì)代謝紊亂［9］，所以我們將LPL作為切入點(diǎn)，觀察肥胖大鼠脂肪組織LPL表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，肥胖大鼠LPL蛋白表達(dá)顯著增高，提示肥胖大鼠血清TC、TG和LDL-C水平的上升，可能引發(fā)機(jī)體的調(diào)控機(jī)制，增強(qiáng)LPL蛋白的表達(dá)來(lái)對(duì)抗脂質(zhì)代謝的異常。國(guó)外有學(xué)者的相關(guān)研究也提示，肥胖大鼠LPL蛋白呈高表達(dá)［10］。經(jīng)過(guò)二陳湯治療后，肥胖大鼠LPL蛋白表達(dá)比模型組進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明二陳湯的干預(yù)促進(jìn)了LPL的高表達(dá)，催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白膽固醇中的TG水解，降低血清中TG水平，本實(shí)驗(yàn)中二陳湯組大鼠血清TG水平的降低也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。二甲雙胍是經(jīng)典的降糖藥物，是新藥研發(fā)的參照基準(zhǔn)，不僅降糖作用顯著，也有很好的減輕體質(zhì)量和糾正血脂異常的作用。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)二甲雙胍干預(yù)后，大鼠LPL蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。Masahiro等［11］學(xué)者在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能使LPL蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，我們將二甲雙胍選為陽(yáng)性對(duì)照藥物，具有較好的對(duì)比作用。引起我們關(guān)注的是，本研究中肥胖大鼠LPLmRNA表達(dá)與正常大鼠無(wú)顯著性差異，而LPL蛋白表達(dá)出現(xiàn)了顯著性差異，這些差異說(shuō)明，藥物對(duì)LPL的影響可能主要表現(xiàn)在翻譯和翻譯后水平上。

肥胖和其他慢性疾病一樣，致病因素和機(jī)制非常復(fù)雜，涉及許多炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的相互作用，關(guān)系到機(jī)體的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)。傳統(tǒng)方藥成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)眾多，我們的前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)二陳湯能促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂小鼠細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5調(diào)控相關(guān)蛋白1類似物1（CDKAL1）的表達(dá)，從而改善胰島細(xì)胞功能，提高胰島素水平［12］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)二陳湯可能通過(guò)促進(jìn)LPL蛋白的表達(dá)來(lái)糾正脂質(zhì)代謝紊亂，是否還影響其他因子，以及是否還有其他信號(hào)通路協(xié)同作用，有待進(jìn)一步研究。