卓 瑪，趙燕娟，王 剛，索朗斯珠，扎西次仁

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市班戈縣農(nóng)牧科學(xué)技術(shù)服務(wù)站，西藏 那曲 852500）

大腸桿菌(Escherichia coil,E.coil)是埃希菌屬中最為主要的細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧短桿菌，是人和牛等溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的一種正常菌群，對(duì)人和動(dòng)物都有致病性，是目前危害并影響西藏地區(qū)牦牛生產(chǎn)的主要疾病之一。現(xiàn)將其分為6類，即腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸集聚性大腸埃希菌(EAEC)、腸產(chǎn)志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸埃希菌(ESIES)[1-3],其中ETEC是一類引起人和幼畜（犢牛、羔羊、初生仔豬）腹瀉的重要病原菌[4]，出生幼畜被ETEC感染后常因嚴(yán)重腹瀉、脫水而導(dǎo)致死亡，致死率很高，給西藏地區(qū)牦牛生產(chǎn)的工作帶來(lái)極大的不便[1]。目前，國(guó)際上有不少關(guān)于ETEC毒素及分型的相關(guān)研究報(bào)道，但對(duì)西藏地區(qū)牦牛源大腸桿菌的毒力基因方面報(bào)道較少見。隨著科技的日益發(fā)展、人們的經(jīng)濟(jì)來(lái)源的增多以及生活水平的提高，人們對(duì)食物的要求也迅速提高，從以前量的需求到現(xiàn)在發(fā)展為不僅要量也追求質(zhì)的要求，因此，牦牛肉就成為人們極為喜歡的食物，但大腸桿菌病已成為牛群最重要的疾病之一，其感染率越來(lái)越高、發(fā)病率越來(lái)越高，導(dǎo)致死亡率也就越來(lái)越高，給牦牛業(yè)以及相應(yīng)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了極為嚴(yán)重的危害，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，本試驗(yàn)選取西藏班戈縣高寒生態(tài)奶牛廠的幼畜和成年牦牛的腹瀉糞樣及肛門拭子進(jìn)行研究，主要是了解西藏牦牛源大腸桿菌毒力及毒力基因的分布情況，為西藏牦牛源大腸桿菌病的預(yù)防以及用藥提供相應(yīng)科學(xué)依據(jù)，以便參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)病料

本試驗(yàn)于2018年8月份從西藏班戈縣無(wú)菌采集了90份腹瀉糞樣和肛門拭子。

1.2 檢測(cè)試劑

氯霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素、頭孢唑啉、鏈霉素、青霉素、丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、復(fù)方諾明、紅霉素等14種藥敏片及普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6021型真空干燥箱均購(gòu)自北京市六一儀器廠；AB204-N型電子分析天平購(gòu)自上海醫(yī)用核子有限公司；SW-CJ-JC超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司；4S Red plus、PCR試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

將采集的90份樣品加入適量的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分離培養(yǎng)時(shí)在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)采用劃線法劃線接種在相應(yīng)的普通瓊脂培養(yǎng)基、普通麥康凱瓊脂和伊紅美蘭瓊脂的平板上，接種時(shí)因注意接種環(huán)的溫度不宜過(guò)高，以免殺死病原菌，接種完后，將其培養(yǎng)基倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)[5]。

2.2 引物設(shè)計(jì)

參考基因庫(kù)所錄的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌毒力基因序列，用DNA 序列軟件找出保守序列，采用Primer 5設(shè)計(jì)引物[6-7]（表1），由上海生物工程有限公司合成。

2.3 PCR檢測(cè)

反應(yīng)條件及相應(yīng)的反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[8]，反應(yīng)結(jié)束后5μl PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.4 生化試驗(yàn)

按參照文獻(xiàn)[9]，進(jìn)行15項(xiàng)生化試驗(yàn)。將試驗(yàn)菌株分別接種于各個(gè)生化管中，37℃、24～48 h培養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌株用移液槍各吸取1 000μl置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并用涂菌棒涂抹均勻，標(biāo)號(hào)。將購(gòu)買的14種抗生素藥敏片按區(qū)域分別貼于培養(yǎng)基中，倒置放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察。 藥敏試驗(yàn)按照CLS推薦的K-B法進(jìn)行。抑菌結(jié)果可根據(jù)NCCLS(2013)公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感、中 介、耐 藥 3 種形式對(duì)抑菌圈的大小作出標(biāo)準(zhǔn)的判定[10]（表2）。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定

本試驗(yàn)菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出粉紅色的單一菌落；在普通培養(yǎng)基上長(zhǎng)出無(wú)色單一的菌落，邊緣整齊、稍凸起、光滑并兼濕潤(rùn)；在伊紅美蘭培養(yǎng)基上長(zhǎng)出黑色帶金屬光澤的單一菌落；染色鏡檢為粉紅色、短桿狀、兩端鈍圓，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 部分菌株染色鏡檢圖

3.2 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：6株疑似腸產(chǎn)毒性大腸桿菌均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖均能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；吲哚、硫化氫、硝酸鹽、明膠、M-R試驗(yàn)均為陽(yáng)性；肌醇、山梨醇、V-P、檸檬酸、尿素試驗(yàn)均為陰性，結(jié)果詳見表5，由表可知本試驗(yàn)分離菌株的生化特性與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本保持一致[11]。結(jié)果見表3。

表1 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序所用引物

表2 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.3 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的毒力分型鑒定

對(duì)疑似牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌22對(duì)毒力基因進(jìn)行引物檢測(cè)時(shí)，只檢出兩對(duì)（STP和CS8）毒力基因，共檢測(cè)出6株腸腸毒素性大腸桿菌，其檢出率均為33.33% ，檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖3 CS8基因及stp基因重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖

3.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：6株腸產(chǎn)毒性大腸桿菌除了對(duì)青霉素和紅霉素不敏感外，其余藥物均為高度敏感[12]，見表4、表5。

4 討論與分析

本研究對(duì)西藏班戈縣散養(yǎng)牦牛牛群的病料進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定，通過(guò)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基跟伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)特性與大腸桿菌特性基本相同的情況下做出初步確定。且本菌通過(guò)革蘭氏染色觀察得陰性菌，中等大小的桿菌，菌體兩端鈍圓，散在或單個(gè)存在；通過(guò)生化試驗(yàn)再次證明本試驗(yàn)菌株符合大腸桿菌的生化特性。因此，本試驗(yàn)6株病原菌的培養(yǎng)鑒定、革蘭氏染色特點(diǎn)、生化特性的結(jié)果均符合大腸桿菌的分離培養(yǎng)特性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符。

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)疑似牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌22對(duì)毒力基因進(jìn)行引物檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)出兩對(duì)（STP和CS8）毒力基因，共檢測(cè)出6株腸腸毒素性大腸桿菌，檢出率均為33.33% 。此檢測(cè)結(jié)果與相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道相符。

表4 常用的14種抗生素的藥敏片法抑菌結(jié)果

表5 6株牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌對(duì)14種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性分析試驗(yàn)表明：在14種常用的抗菌藥物（氯霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素、頭孢唑、鏈霉素、青霉素、丁胺卡那、四黃素、阿奇霉素、復(fù)方諾明、紅霉素、呋喃妥因、慶大霉素、頭孢西?。┲?，病原菌對(duì)青霉素和紅霉素不敏感，造成這樣的主要原因可能是因?yàn)榍嗝顾睾图t霉素在臨床上廣泛應(yīng)用使細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。除了對(duì)青霉素不敏感外，其余藥物均為高度敏感。由此表明，西藏班戈縣應(yīng)加大對(duì)大腸桿菌病的重視，臨床診斷及治療時(shí)，一定要根據(jù)具體條件并結(jié)合藥敏試驗(yàn)合理選藥，尤其是腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌菌株的毒力相當(dāng)強(qiáng)，一旦引發(fā)此病必定會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)以及各方面的損失。通過(guò)藥敏試驗(yàn)為保護(hù)班戈縣牦牛生態(tài)廠牦牛大腸桿菌病的防治提供了有利的依據(jù)，更重要的是為西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的預(yù)防及防治措施提供了相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)[13]。

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降的情況下方可引起犢牛及成年牦牛的發(fā)病。因此，除了定期注射疫苗外，還要加強(qiáng)對(duì)牦牛的飼養(yǎng)管理、加強(qiáng)檢疫，其最主要的是維護(hù)動(dòng)物并提供自身所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使機(jī)體各項(xiàng)指標(biāo)處于平衡狀態(tài)，此法對(duì)預(yù)防和控制大腸桿菌病的發(fā)生有一定的科學(xué)意義[10-15]。

本次試驗(yàn)從嚴(yán)重腹瀉的牦牛糞便及肝門試子中分離到了產(chǎn)毒素性大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn),因此發(fā)生該病時(shí)，應(yīng)該選擇對(duì)此菌敏感的藥物進(jìn)行治療。臨床用藥時(shí)應(yīng)有針對(duì)性，應(yīng)該根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)此菌敏感的藥物進(jìn)行治療，亂用或?yàn)E用抗生素藥物，會(huì)造成一些不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)，不僅容易導(dǎo)致臨床耐藥菌株的增多，會(huì)造成治療的不完善及失敗，而且隨之大腸桿菌耐藥菌株的增多，給臨床用藥帶來(lái)了極大的困難。曾有學(xué)者提出牦牛中帶耐藥菌株的大腸桿菌可以通過(guò)動(dòng)物的飼料和牦牛肉食品的加工逐漸感染到人的體內(nèi)，獸醫(yī)臨床耐藥菌株的不斷增多可能是就是造成人醫(yī)潛在的威脅。牦牛綠色食品正受到臨床濫用抗生素的威脅，所以通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用藥是當(dāng)務(wù)之急[16]。