羅潤(rùn)波,高家登,錢雯嫻,周賽賽,索朗斯珠*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，西藏 那曲 852000）

產(chǎn)氣莢膜梭菌，舊稱魏氏梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌，是一種臨床條件致病菌，廣泛分布于人、環(huán)境和牲畜的胃腸道[1-4]，是造成動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽的主要病原菌之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的毒素種類較多，目前已發(fā)現(xiàn)的毒素至少20種[5]，且均為蛋白質(zhì)。根據(jù)該菌產(chǎn)生四種主要致死性毒素（α、β、ε和ι）的種類不同而被分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι） 五 種毒素類型[6]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的牦牛疾病時(shí)有報(bào)道[7-9]。西藏地區(qū)也有發(fā)生不明原因的牦牛死亡，死亡?？梢?jiàn)四肢前后伸直、口腔流液體、肛門外翻且充血、腹瀉等癥狀，部分牦牛病程3～5 d、有的1 d死亡。剖檢可見(jiàn)實(shí)質(zhì)器官的廣泛性出血。小腸針尖樣出血，也可見(jiàn)“血腸樣”，大腸充氣、黏膜出血，膽囊高度腫脹，膀胱積尿，皺胃黏膜充血，瘤胃可見(jiàn)血塊。

為確診該病病原，本試驗(yàn)采集病死牦牛的肝臟、腎臟、心臟、脾臟、小腸內(nèi)容物等病料，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離，通過(guò)分離鑒定，以確定引起該牦牛死亡的主要病原菌。

1 主要材料

1.1 病料

采集一頭疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起死亡的牦牛的肝臟、腎臟、心臟、脾臟以及小腸內(nèi)容物。

1.2 主要試劑及儀器

哥倫比亞血瓊脂平板（江門市凱林貿(mào)易有限公司），厭氧罐、厭氧產(chǎn)氣袋（日本三菱化學(xué)公司），厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），生化鑒定管（青島海博生物技術(shù)有限公司），引物合成（生工生物工程上海股份有限公司），PCR相關(guān)試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad生產(chǎn)）。

2 細(xì)菌的分離鑒定

2.1 病料接種

將病料接種在厭氧肉肝湯中，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)菌是否生長(zhǎng)和產(chǎn)氣。同時(shí)將病料進(jìn)行觸片，革蘭氏染色鏡檢，觀察病料中細(xì)菌的形態(tài)特征。

2.2 分離培養(yǎng)

將厭氧肉肝湯中明顯渾濁并有氣體產(chǎn)生的菌液，在哥倫比亞血平皿上劃線，血平皿放入?yún)捬豕?7℃培養(yǎng)18～24 h。

挑取哥倫比亞血平皿上有細(xì)菌生長(zhǎng)、并形成溶血環(huán)的單菌落，進(jìn)行細(xì)菌涂片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察細(xì)菌是否與病料觸片染色鏡檢結(jié)果相同。鏡檢結(jié)果一致的菌落接種在梭菌增菌培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 生化試驗(yàn)

生化鑒定參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[10]，將上述菌液分別接種于新鮮制備的石蕊牛奶培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基中，并分別接種到吲哚、酯酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、水楊苷等生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)，24 h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 16S rRNA的分子生物學(xué)鑒定

取梭菌增菌培養(yǎng)基中的分離菌純培養(yǎng)物，進(jìn)行集菌，并采用煮沸法獲得總DNA。采用細(xì)菌16S rRNA的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[11]，引物信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系，50 μl：DNA模板2 μl，2× Mix 25 μl，上、下有引物各1 μl ，ddH2O 21 μl。PCR反應(yīng)體系94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶切膠回收，然后連接T載，連接后轉(zhuǎn)化到Trans5α，挑選陽(yáng)性菌送“生工生物工程（上海）股份有限公司”測(cè)序。并在GenBank中進(jìn)行比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1 分離菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

細(xì)菌在哥倫比亞血平皿上可見(jiàn)菌落凸起，呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，菌落周圍有明顯的溶血環(huán)。細(xì)菌厭氧生長(zhǎng)，在厭氧肉肝湯中生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)生大量氣體，培養(yǎng)基混濁。

3.2 分離菌菌體形態(tài)

挑取哥倫比亞血平皿上形成溶血環(huán)的單菌落進(jìn)行涂片，用革蘭氏染色，鏡下見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，單個(gè)或成雙存在，兩端鈍圓，形態(tài)粗短，無(wú)鞭毛。病料觸片染色結(jié)果與哥倫比亞血液瓊脂平板上有溶血環(huán)的菌落的菌體形態(tài)一致。

3.3 分離菌的生化試驗(yàn)

該分離菌接種到石蕊牛奶培養(yǎng)基中，表現(xiàn)為明顯的“洶涌發(fā)酵”。其余生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 16S rRNA 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以分離菌總DNA為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳，結(jié)果顯示與預(yù)期大小1300 bp一致，見(jiàn)圖1。將PCR產(chǎn)物回收連接T載體后轉(zhuǎn)化到Trans5α進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該分離菌的16S rRNA序列得到了有效擴(kuò)增，序列比對(duì)結(jié)果顯示分離株與產(chǎn)氣莢膜梭菌XJWB01（GenBank登 錄 號(hào)：KX094441.1） 和KSJ-23（GenBank登錄號(hào)： MG462900.1），同源性均為99.47%。表明分離菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4 小結(jié)及討論

本研究通過(guò)臨床癥狀的初步判定并進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)，成功分離得到西藏那曲市牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌1株。

表1 16S rRNA生物學(xué)鑒定引物

表2 分離菌生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 16S rRNA特異性鑒定

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種梭狀芽孢桿菌屬的條件性致病菌，同時(shí)也是動(dòng)物腸道中的正常菌群之一[1-3]，動(dòng)物機(jī)體的抵抗力一旦下降，可致使腸道內(nèi)的產(chǎn)氣莢膜梭菌大量增殖產(chǎn)生外毒素，外毒素能使腸壁通透性增加，而后細(xì)菌和毒素就會(huì)透過(guò)腸壁，進(jìn)入血液，從而引起毒血癥或者敗血癥，實(shí)質(zhì)性器官則受損嚴(yán)重［12］。本研究從采集的實(shí)質(zhì)性器官和小腸中均分離到了產(chǎn)氣莢膜梭菌，基本可以確診牦牛的死亡由該病原菌引起。

該菌是人獸共患傳染病原，能引起人類食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽。人類、畜禽以及土壤、污水中最常見(jiàn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是牛的“猝死癥”的主要病原之一[14]。同時(shí)A型和B型產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起牛的腸毒血癥病。但近幾年，D型梭菌導(dǎo)致的牛腸毒血癥呈上升趨勢(shì)[15]，國(guó)外則多見(jiàn)C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌[16]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道E型產(chǎn)氣莢膜梭菌能感染牦牛，引起一系列疾病[17]。本次分離得到的1株牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌具體是何種毒素型，有待進(jìn)一步研究。

臨床上，應(yīng)提高對(duì)該病的重視，有條件的可以進(jìn)行相應(yīng)的疫苗預(yù)防。對(duì)于患病牦牛，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行隔離治療，主要是鎮(zhèn)靜、消炎和強(qiáng)心。對(duì)于死亡牦牛要嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)害化處理，同時(shí)要注意場(chǎng)地的消毒。