劉湘鈺， 劉寬智， 張新建

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510378；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510080）

肝切除、肝移植、出血性休克或嚴(yán)重膿毒癥等可造成肝缺血再灌注損傷，進(jìn)而引發(fā)肝功能障礙或衰竭[1]。缺血狀態(tài)可造成肝細(xì)胞供氧不足及能量中斷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，缺血狀態(tài)下產(chǎn)生大量的活性氧成分以及炎癥介質(zhì)均可造成再灌注過程中細(xì)胞凋亡和肝功能障礙[2，3]。目前，對(duì)于肝缺血再灌注損傷的治療以支持治療為主，尚無具體針對(duì)性的治療方法。丹皮酚（Paeonole）是中藥丹皮的主要活性成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)微循環(huán)等藥理作用[4-10]。既往研究表明丹皮酚對(duì)腦缺血再灌注損傷有修復(fù)作用[9，10]。本研究擬通過復(fù)制大鼠肝缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用丹皮酚干預(yù)，進(jìn)一步觀察其對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)的影響，以探討丹皮酚對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的防治作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只3月齡健康SPF級(jí)SD雄性大鼠，購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（粵）2017-0081。全部動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.2藥品、試劑與儀器丹皮酚（北京普天同創(chuàng)生物科技公司，純度99%，批號(hào)：17050910）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（深圳子科生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（碧云天科技有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國(guó)Cayman公司）；TRIzol（美國(guó)MRC公司，批號(hào)：TR118-500）；M-MLV Reverse Transcriptase（上海Promega 公 司 ， 批 號(hào) ： M1705）； GoTaq?qPCR Master Mix（上海Promega公司，批號(hào)：A6002）。全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Johnson公司）；TGL-16R冷凍高速離心機(jī)（上海Hema公司）；XK-400手掌離心機(jī)（新莊醫(yī)療器械）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Hema9600基因擴(kuò)增儀（上海Hema公司）；MiniOpticon Real-time Quantitative PCR（美國(guó)Bio-Rad公司）；UV-752P紫外可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器）。

1.3大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型的復(fù)制方法大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水，依據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法復(fù)制肝臟缺血再灌注損傷模型。操作方法：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒。沿腹部中線打開腹腔，分離肝臟周圍組織，暴露肝門，用小號(hào)動(dòng)脈夾阻斷左、中葉肝蒂，完全阻斷左、中葉肝臟血流，造成受累肝葉完全缺血，保留肝右葉、尾狀葉（約占全肝30%）血供。阻斷60 min后去除肝蒂阻斷夾，恢復(fù)肝臟灌流。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模與給藥將SD大鼠隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組、模型組、丹皮酚組，每組8只。假手術(shù)組：僅暴露肝門，不夾閉動(dòng)、靜脈。模型組：復(fù)制肝缺血再灌注損傷模型，于阻斷前30 min和開放后10 min分別靜脈注射與丹皮酚組等容量的生理鹽水。丹皮酚組：復(fù)制肝缺血再灌注損傷模型，夾閉左、中葉肝蒂60 min后恢復(fù)灌注，再灌注24 h后取材。依據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，相比對(duì)照組，丹皮酚在低劑量（5 mg/kg）以上時(shí)，對(duì)組織缺血再灌注有顯著的保護(hù)作用，因此本研究中，丹皮酚劑量擬定為5 mg/kg，于阻斷前30 min和開放后10 min分別腹腔注射給藥。

1.5觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 血清ALT、AST檢測(cè) 于再灌注后24 h抽取大鼠下腔靜脈血樣，4℃3 000 r/min離心5 min，取上層血清并保存于-80℃冰箱中備用。按操作說明使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST水平。

1.5.2 病理學(xué)觀察 取大鼠肝左前葉組織，用10%中性甲醛固定，常規(guī)石醋包埋、切片，蘇木素——伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

1.5.3 血清TNF-α含量檢測(cè) 于再灌注后24 h抽取大鼠下腔靜脈血樣，4℃3 000 r/min離心5 min，取上層血清并保存于-80℃冰箱中備用。采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α的水平，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在波長(zhǎng)450 nm處取其吸光度（OD）值。具體操作步驟按試劑說明書進(jìn)行。

1.5.4 肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 再灌注后24 h處死各組大鼠并取出部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中備用。逆轉(zhuǎn)錄采用聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)TNF-α mRNA表達(dá)水平。按照TRIzol說明書提取肝組織總RNA。取1 mg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。TNF-α引物由上海生工合成。TNF-α上游引物序列為5’-CACCACGCTCTTCTGT C-3’，下游5’-CTACGGGCTTGTCACTC-3’，擴(kuò)增片段為146 bp。采用Real-time Quantitative PCR儀，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以樣本Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)依次計(jì)算。

1.5.5 肝組織MPO活性檢測(cè) 再灌注后24 h處死各組大鼠并取出部分肝臟組織保存于-80℃冰箱中備用。生理鹽水清洗后上自動(dòng)勻漿機(jī)制成勻漿，3 000 r/min離心15 min取上清液。采用ELISA法檢測(cè)肝組織MPO活性，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，取其在波長(zhǎng)450 nm處的OD值。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹皮酚對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT、AST的影響表1結(jié)果顯示：3組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠血清ALT、AST水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 丹皮酚對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠血清ALT、AST的影響Table 1 The effect of paeonol on the serum levels of ALT and AST in hepatic ischemia-reperfusion injury rats[-x±s，J/（U·L-1）]

2.2丹皮酚對(duì)缺血再灌注損傷大鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)的影響圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組可見肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見細(xì)胞變性等病理變化。與假手術(shù)組比較，模型組中肝細(xì)胞廣泛壞死，并可見細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核碎裂以及胞質(zhì)空泡樣變等病理表現(xiàn)。而丹皮酚組可見肝細(xì)胞大部分保持清晰的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列雖可見部分紊亂，但是細(xì)胞壞死、腫脹以及空泡樣變等病理現(xiàn)象少見。

圖1 各組大鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological features of liver tissue in various groups（by HE staining，×200）

表2 各組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the serum TNF-α content and the expression level of TNF-α mRNA in hepatic tissue of various groups (-x±s)

2.3丹皮酚對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠血清TNF-α含量及肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示丹皮酚可減輕大鼠肝缺血再灌注損傷時(shí)TNF-α的釋放。

2.4丹皮酚對(duì)缺血再灌注損傷大鼠肝組織MPO活性的影響表3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織MPO活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹皮酚組大鼠肝組織MPO活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示丹皮酚可減輕肝缺血再灌注損傷模型大鼠肝組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。

表3 各組大鼠肝組織MPO活性比較Table 3 Comparison of the MPO activity in hepatic tissue of various groups (-x±s)

3 討論

本研究結(jié)果顯示肝缺血再灌注損傷造模大鼠血清ALT、AST升高，并見肝細(xì)胞腫脹、壞死、核裂解等病理損傷，表明大鼠肝缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功。

肝缺血再灌注損傷是肝臟手術(shù)和移植術(shù)后的并發(fā)癥，?？梢鸶喂δ懿蝗?，是導(dǎo)致肝臟手術(shù)和肝臟移植手術(shù)失敗或患者死亡的主要原因之一[12]。肝缺血再灌注損傷的過程復(fù)雜，有許多細(xì)胞和生物分子通過各種通路參與其中，包括肝細(xì)胞厭氧代謝、線粒體損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、細(xì)胞因子、趨化因子以及中性粒細(xì)胞等[13，14]。

在肝缺血再灌注損傷中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，其中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)常常是造成組織損傷加重的重要因素之一，因此，通過減少或控制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的治療有可能是有效的應(yīng)對(duì)措施[15]。當(dāng)肝缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞因子和趨化因子可以激活中性粒細(xì)胞并將其聚集到肝臟缺血部位，大量浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞通過釋放炎性介質(zhì)、細(xì)胞毒產(chǎn)物、氧自由基等來引起一系列病理反應(yīng)，從而造成肝細(xì)胞損傷和壞死，進(jìn)而造成肝功能障礙等。王萬鐵等[16]研究表明在家兔肝缺血再灌注損傷模型中，隨著缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織中的中性粒細(xì)胞聚集程度加重，同時(shí)也伴隨著肝細(xì)胞病理變化加劇。MPO是中性粒細(xì)胞募集和活化后釋放的主要分子之一，其在中性粒細(xì)胞中高表達(dá)，是中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物，其活性與組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度有關(guān)，并參與肝缺血再灌注損傷的病理生理反應(yīng)的過程[17]。Kato等[18]在小鼠肝缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)MPO活性增加和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加與肝細(xì)胞壞死相一致。本研究結(jié)果顯示大鼠肝缺血再灌注肝組織MPO活性明顯上升，這提示存在中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)。

TNF-α是一個(gè)具有多種效應(yīng)的細(xì)胞因子，既可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、代謝活化，也可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)甚至引發(fā)細(xì)胞死亡[19]。當(dāng)發(fā)生肝缺血再灌注損傷時(shí)，肝臟中的Kupffer細(xì)胞在再灌注過程中發(fā)揮著核心作用，其主要通過再灌注早期釋放大量活性氧分子（Reactive oxygen species，ROS）來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及釋放大量促炎癥細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)來直接殺傷組織[20]。TNF-α作為Kupffer細(xì)胞釋放的促炎癥因子之一，對(duì)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)起著重要作用。研究[21]表明TNF-α可通過與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生大量上皮嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，活化ROS、NF-κB以及促分裂原活化蛋白激酶等來直接殺傷肝細(xì)胞。另外，TNF-α可促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecules 1，VCAM1）及 P選擇素等黏附分子的表達(dá)，這些黏附分子大量聚集可激活中性粒細(xì)胞并使之進(jìn)入肝臟缺血組織，從而損傷肝細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示大鼠肝缺血再灌注24 h后血清TNF-α及肝臟組織TNF-α均顯著升高，提示TNF-α參與了肝缺血再灌注損傷的過程。

丹皮酚作為預(yù)防肝缺血再灌注損傷的熱點(diǎn)藥物，本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，丹皮酚組血清ALT、AST，血清TNF-α、肝組織TNF-α表達(dá)水平及MPO活性明顯降低，肝細(xì)胞壞死、病理性損傷明顯減輕。提示丹皮酚預(yù)處理可減輕肝缺血再灌注損傷，具有保護(hù)作用。其中，經(jīng)丹皮酚預(yù)處理后MPO活性顯著降低（P＜0.05）的結(jié)果，亦提示丹皮酚可以通過減少肝組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)來減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)受損的肝臟組織。經(jīng)丹皮酚預(yù)處理后大鼠血清TNF-α及肝組織TNF-α較模型組顯著下降（P＜0.05）的結(jié)果，亦提示丹皮酚預(yù)處理可以減少TNF-α的生成、釋放以及其隨后帶來的炎性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟組織的保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制可能與抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，丹皮酚能減輕大鼠肝缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥因子TNF-α的釋放有關(guān)。