蘆智遠(yuǎn), 王 冰, 田 娜, 張耀武*, 張新宇, 劉 佳, 呂 巖

(1. 西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院, 陜西 西安 710065; 2. 西安計(jì)量技術(shù)研究院, 陜西 西安 710086)

面皮是我國(guó)傳統(tǒng)的特色小吃,隨著食品工業(yè)的發(fā)展,在保留傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上,增加真空包裝、巴氏殺菌等生產(chǎn)工藝,面皮行業(yè)已逐步擺脫了無包裝、保質(zhì)期短的缺點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了面皮產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化、速食化。但在真空包裝過程中,引入復(fù)合包裝材料帶來的食品安全隱患,也應(yīng)引起足夠的重視。復(fù)合食品包裝材料的生產(chǎn),一般需要用到含有甲苯二異氰酸酯(TDI)的黏合劑,TDI極易發(fā)生水解,生成芳香胺類化合物2,4-二氨基甲苯[1],相關(guān)研究表明2,4-二氨基甲苯對(duì)黏膜、呼吸道及皮膚有刺激作用,中毒表現(xiàn)有支氣管炎、氣管炎、喘息等,人體長(zhǎng)期接觸可能致癌、致基因突變[2]。

方便面皮標(biāo)簽明示的食用方法一般包括蒸、水煮和微波3種加熱方式,其中水煮和微波加熱法是將面皮連同內(nèi)包裝袋一起加熱,這就加快了包裝材料中2,4-二氨基甲苯向食品的遷移。本文擬建立一套高效準(zhǔn)確的2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè)方法,并應(yīng)用于采集樣本的檢測(cè),調(diào)研目前面皮行業(yè)包裝材料中2,4-二氨基甲苯的污染情況。

針對(duì)2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè),從2003年國(guó)家衛(wèi)生部發(fā)布的GB/T 5009.119-2003[3]到2016年發(fā)布的GB 31604.23-2016[4],國(guó)標(biāo)方法由氣相色譜法已逐步向氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方向發(fā)展。除此以外,還有近年來文獻(xiàn)報(bào)道的氣相色譜法[5-11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-16]等,但以上檢測(cè)方法的前處理過程主要是利用氨基堿性的性質(zhì),對(duì)遷移溶液堿化處理,液液萃取將分子態(tài)的2,4-二氨基甲苯提取至有機(jī)相。然而液液萃取的提取方式操作繁瑣,有機(jī)試劑消耗量大,同時(shí)萃取效果也易受pH值的影響。解偉欣等[17]應(yīng)用反相固相萃取技術(shù)對(duì)二氨基甲苯進(jìn)行濃縮富集,但是為了增強(qiáng)二氨基甲苯在反相固相萃取柱上的保留,過柱前仍需堿化處理。因此,簡(jiǎn)化提取操作流程依舊是目前2,4-二氨基甲苯遷移量檢測(cè)的難點(diǎn)。

離子交換型固相萃取技術(shù)具有針對(duì)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、高效、有機(jī)試劑消耗量少等優(yōu)勢(shì),目前,將離子交換型固相萃取應(yīng)用于2,4-二氨基甲苯的檢測(cè)方法暫無報(bào)道,本文擬采用混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱濃縮凈化遷移溶液,利用磺酸基對(duì)堿性化合物良好的保留性質(zhì),解決在酸性條件下反相吸附劑對(duì)2,4-二氨基甲苯無法吸附保留的問題,簡(jiǎn)化前處理過程,再結(jié)合GC-MS定性準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),建立一套離子交換固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定方便面皮復(fù)合包裝袋中2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司); Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司); AUTOTRACE 280固相萃取儀(美國(guó)Dionex公司); MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司); DHG-9140A烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

碳酸氫鈉、冰乙酸為分析純(科密歐化學(xué)試劑有限公司);氨水為分析純(成都市科龍化工試劑廠);乙酸乙酯、甲醇為色譜純(美國(guó)霍尼韋爾公司); MCX固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL)、C18固相萃取柱(500 mg, 6 mL),購(gòu)于美國(guó)Waters公司;2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;七氟丁酸酐(純度98.0%)購(gòu)于瑪雅試劑有限公司。

2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.1 mg)2,4-二氨基甲苯,用乙酸乙酯定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃條件下保存。用乙酸乙酯稀釋至1 mg/L,得2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)使用液。再用乙酸乙酯將標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋成1、5、10、25、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 前處理方法

1.3.1遷移試驗(yàn)

參照GB 31604.23-2016,移出面皮內(nèi)包裝袋中全部食品,用水沖洗內(nèi)包裝袋至無污物,再用水洗3次,淋干。按照2 mL/cm2(內(nèi)表面積)裝入乙酸溶液,熱封口,置于120 ℃±5 ℃條件下恒溫40 min。遷移試驗(yàn)結(jié)束后,自然冷卻至室溫,剪開封口,將溶液轉(zhuǎn)移至干燥燒杯中備用。

1.3.2凈化與富集

選用MCX固相萃取柱。活化溶劑:5 mL甲醇;平衡溶劑:5 mL水;淋洗溶劑:5 mL水;洗脫溶劑:3 mL 5%(v/v)氨化甲醇。上樣量:50.0 mL?；罨魉?3 mL/min;平衡流速:3 mL/min;上樣流速:10 mL/min;淋洗流速:3 mL/min;洗脫流速:3 mL/min。淋洗后吹干2 min,待固相萃取儀運(yùn)行結(jié)束后,收集洗脫液,混勻,在40 ℃下氮吹至近干,用乙酸乙酯定容至2 mL,混勻后待衍生處理。

1.3.3衍生處理

在上述復(fù)溶液中加入50 μL七氟丁酸酐,輕輕混勻,室溫下衍生10 min后,加入4 mL 20 g/L碳酸氫鈉溶液,混勻,待靜置分層后,取有機(jī)層待GC-MS分析。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的制備

取2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)工作液2 mL,加入50 μL七氟丁酸酐按照1.3.3節(jié)步驟進(jìn)行衍生處理,取有機(jī)層待GC-MS分析。

1.4 GC-MS條件

1.4.1氣相色譜條件

毛細(xì)色譜柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃,進(jìn)樣方式:不分流;載氣(He)流速:1.2 mL/min;程序升溫:起始溫度80 ℃,保持1 min,以15 ℃/min的升溫速度至250 ℃,保持2 min;進(jìn)樣量:1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

轟擊電子能量:70 eV; EI源溫度:200 ℃;接口溫度:280 ℃;溶劑延遲:6 min;選擇離子:m/z514、m/z345和m/z317。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生劑條件的選擇

七氟丁酸酐可與2,4-二氨基甲苯上的兩個(gè)氨基發(fā)生衍生化,改善目標(biāo)物的氣相色譜行為。以50 μg/L的2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣本,以衍生產(chǎn)物在GC-MS上的相應(yīng)強(qiáng)度為指標(biāo),分析比較不同衍生條件對(duì)衍生效果的影響。

圖 1 七氟丁酸酐用量對(duì)2,4-二氨基甲苯衍生效果的影響(n=3)Fig. 1 Effect of amount of heptafluorobutyric anhydride on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.1.1衍生劑用量對(duì)衍生效果的影響

在衍生過程中,固定其他衍生條件不變,考察不同衍生劑用量對(duì)衍生效果的影響。取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入30、50、80、150 μL七氟丁酸酐,40 ℃條件下衍生10 min,每個(gè)水平做3次平行試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,當(dāng)衍生劑用量大于50 μL時(shí),峰面積增加不明顯,故由此確定衍生劑的添加量為50 μL。

2.1.2衍生時(shí)間對(duì)衍生效果的影響

在40 ℃條件下,在2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加50 μL七氟丁酸酐,分別衍生2、5、10、15、30 min,每個(gè)水平做3次平行試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可見,七氟丁酸酐與2,4-二氨基甲苯的衍生化反應(yīng)主要發(fā)生在前10 min以內(nèi),10 min后數(shù)據(jù)平穩(wěn),因此確定衍生時(shí)間為10 min。

圖 2 衍生時(shí)間對(duì)2,4-二氨基甲苯衍生效果的影響(n=3)Fig. 2 Effect of time on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.1.3衍生溫度對(duì)衍生效果的影響

取2 mL 50 μg/L的二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加50 μL七氟丁酸酐,分別在20、30、40、60 ℃條件下衍生10 min,每個(gè)水平做3次平行試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見圖3。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著衍生溫度的提高,峰面積相應(yīng)升高,當(dāng)衍生溫度超過40 ℃,峰面積趨于穩(wěn)定,故本方法選用40 ℃作為衍生溫度。

圖 3 衍生溫度對(duì)2,4-二氨基甲苯衍生效果的影響(n=3)Fig. 3 Effect of temperature on the derivatization of 2,4-diaminotoluene (n=3)

2.2 固相萃取柱的選擇

使用C18、HLB分別在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)和pH 8.0(堿化)條件下考察這兩種類型的固相萃取柱對(duì)2,4-二氨基甲苯的保留效果,同時(shí)在4%(v/v)乙酸溶液(pH 2.5)條件下,評(píng)價(jià)MCX小柱對(duì)2,4-二氨基甲苯的富集能力。各類型固相萃取柱的使用方法如下:HLB和C18小柱分別以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡,上樣50 mL(加標(biāo)質(zhì)量濃度50 μg/L),用5 mL水淋洗、3 mL甲醇洗脫;MCX小柱以5 mL甲醇、5 mL水活化平衡,上樣50 mL,用5 mL水淋洗、3 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脫。分別收集C18、HLB和MCX小柱的洗脫液,氮吹至近干,用乙酸乙酯定容至2 mL,混勻,加入50 μL七氟丁酸酐,40 ℃衍生10 min后,加入4 mL 20 g/L碳酸氫鈉溶液,混勻,待靜置分層后,取有機(jī)層待GC-MS分析,測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖 4 固相萃取柱對(duì)2,4-二氨基甲苯回收率的影響Fig. 4 Effect of SPE cartridges on the recovery of 2,4-diaminotoluene

結(jié)果發(fā)現(xiàn),若將乙酸體積分?jǐn)?shù)為4%的遷移溶液直接過柱,C18、HLB對(duì)2,4-二氨基甲苯均無保留,但是若將遷移溶液先進(jìn)行堿化處理后再上樣,目標(biāo)的回收率得到顯著提升;而MCX型固相萃取柱即使在酸性條件下(4%(v/v)乙酸),目標(biāo)物的回收率也非常高。分析原因,這是因?yàn)?,4-二氨基甲苯的分子結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)氨基取代了甲苯2、4位的氫,這使得該化合物具備了親水和親脂的雙重特征,由于遷移試驗(yàn)是在4%(v/v)乙酸溶液中完成的,受溶液pH環(huán)境影響,2,4-二氨基甲苯基本以離子形態(tài)存在,因此無法直接使用烷基柱或二乙烯苯柱對(duì)2,4-二氨基甲苯進(jìn)行保留。MCX柱屬于混合型陽(yáng)離子交換柱,磺酸基對(duì)堿性化合物具有良好的保留能力,與二乙烯苯的親脂基團(tuán)協(xié)同作用,因此不再受pH值的影響,可以有效地富集目標(biāo)物。因此,確定選擇MCX混合型陽(yáng)離子交換柱。

2.3 洗脫體積的確定

洗脫是固相萃取技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),洗脫液用量過大會(huì)影響檢測(cè)的工作效率,用量過小會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的回收率不高。以50 mL 4%(v/v)乙酸溶液(加標(biāo)質(zhì)量濃度50 μg/L)模擬遷移溶液,固相萃取柱依次經(jīng)活化、平衡、上樣、淋洗除雜后,分別加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL 5%(v/v)氨化甲醇洗脫,考察洗脫溶劑體積對(duì)目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖5。

圖 5 洗脫體積對(duì)2,4-二氨基甲苯回收率的影響Fig. 5 Effect of elution volume on the recovery of 2,4-diaminotoluene

結(jié)果表明,當(dāng)洗脫液體積超過3.0 mL時(shí),回收率達(dá)到92.28%,且基本保持不變,說明此時(shí)2,4-二氨基甲苯已經(jīng)完全洗脫,因此確定洗脫液的體積為3.0 mL。

2.4 二氨基甲苯的質(zhì)譜分析

2,4-二氨基甲苯與衍生劑七氟丁酸酐反應(yīng)生成2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯,反應(yīng)式見圖6。在電子轟擊能量70 eV、全掃描采集模式條件下,設(shè)置質(zhì)量掃描范圍為40～550 u, 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯質(zhì)譜分析得到的全掃描質(zhì)譜圖見圖7。

圖 6 2,4-二氨基甲苯與七氟丁酸酐的反應(yīng)式Fig. 6 Reaction of 2,4-diaminotoluene with heptafluorobutyric anhydride

圖 7 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯的全掃描質(zhì)譜圖Fig. 7 Full scan spectrum of 2,4-bis(heptafluoro-butylamide) toluene

2,4-二氨基甲苯的衍生物2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯的相對(duì)分子質(zhì)量為514,經(jīng)離子源轟擊后,產(chǎn)生分子離子碎片m/z514(失去電子)、m/z345(失去C3F7)、m/z317(失去電子COC3F7)等(見圖8),根據(jù)豐度,選擇m/z345作為定量離子,m/z514、m/z317為參比離子。

圖 8 2,4-二(七氟丁酰氨基)甲苯離子碎片的推導(dǎo)Fig. 8 Derivation of ion fragments of 2,4-bis(heptafluorobutylamide) toluene

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1線性范圍、檢出限與定量限

對(duì)質(zhì)量濃度分別為1、5、10、25、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.4節(jié)色譜及質(zhì)譜條件建立峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x, μg/L)的線性關(guān)系,結(jié)果表明,2,4-二氨基甲苯在1～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,線性方程為y=1 154x-645,線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 1。選取未檢出2,4-二氨基甲苯的包裝袋浸泡液為空白基質(zhì),在5 μg/L的添加水平下,以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限,10倍信噪比計(jì)算定量限,當(dāng)取樣量50.0 mL,定容體積為2 mL時(shí),2,4-二氨基甲苯的檢出限為0.2 μg/L,定量限為0.6 μg/L。

2.5.2回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在空白基質(zhì)浸泡液中添加1 mg/L的2,4-二氨基甲苯標(biāo)準(zhǔn)使用液,配制成1、10、50 μg/L 3個(gè)水平的加標(biāo)樣品,進(jìn)行樣品加標(biāo)試驗(yàn),每個(gè)水平測(cè)定6次,計(jì)算回收率及精密度。結(jié)果表明,本方法的平均回收率在89.0%～94.2%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.6%。回收率和精密度均能滿足定量要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表 1 2,4-二氨基甲苯在樣品中的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

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2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

面皮行業(yè)的發(fā)展已規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化,如陜西關(guān)中的寶雞、西安等地,生產(chǎn)企業(yè)及小作坊數(shù)量眾多。使用本文建立的檢測(cè)方法對(duì)采集到的67份方便面皮復(fù)合包裝袋樣品進(jìn)行檢測(cè)(樣本包括陜西生產(chǎn)企業(yè)32家、小作坊17家、超市自封2份、遼寧3份、甘肅3份、北京2份、河北1份、山西1份、廣東1份、四川2份、河南1份、福建2份等),其中兩個(gè)樣品2,4-二氨基甲苯的結(jié)果呈陽(yáng)性,分別為1.4 μg/L和0.8 μg/L,但符合GB 9683-88《復(fù)合食品包裝袋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[18]限量要求(≤0.004 mg/L),其余65個(gè)樣品未檢出2,4-二氨基甲苯。

3 結(jié)論

本文建立了離子交換固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定方便面皮復(fù)合包裝袋中2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè)方法,采用MCX混合型陽(yáng)離子交換柱,利用其磺酸基對(duì)堿性化合物良好的保留性質(zhì),對(duì)遷移溶液中的2,4-二氨基甲苯進(jìn)行富集和凈化。該前處理方法相較已報(bào)道的2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè)方法[4-16],無需調(diào)節(jié)遷移溶液的pH值,遷移溶液可以直接過柱進(jìn)行目標(biāo)物的濃縮。該方法大幅度縮短了前處理時(shí)間,減小了有機(jī)溶劑的使用量,操作便捷,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適用于方便面皮復(fù)合包裝袋中2,4-二氨基甲苯遷移量的檢測(cè)。