馮麗雄,彭 鶯,吳偉東,萬恒興

(深圳技師學(xué)院應(yīng)用生物系，廣東 深圳 518116)

頭孢噻肟鈉又名：凱福隆、頭孢氨噻肟、西孢克拉瑞、CTX[1]，是第三代頭孢菌素類抗生素，抗菌譜廣,對大腸埃希菌、奇異變形桿菌、克雷伯菌屬和沙門菌屬等腸桿菌科細菌等格蘭陰性菌有強大活性,對普通變形桿菌和枸櫞酸桿菌屬亦有良好作用[2]?？咕鷻C制是抑制細菌細胞壁的形成[3-4]，在臨床上主要用于治療由各種敏感菌引起的的感染，如呼吸道、皮膚軟組織、泌尿系統(tǒng)、創(chuàng)傷及術(shù)后等感染[5]。乙酸是第三類殘留溶劑[6]。實際生產(chǎn)中，由頭孢噻肟酸制成頭孢噻肟鈉無菌原料時，選擇乙酸鈉與頭孢噻肟酸進行復(fù)分解反應(yīng)，生成頭孢噻肟鈉和乙酸。乙酸為頭孢噻肟鈉合成過程中可能生成的副產(chǎn)物[7]。目前對乙酸的分析方法主要要有滴定法、薄層層析法、分光光度法、熒光法、氣相色譜法以及酶法等[8]。本文建立高效液相色譜法測定頭孢噻肟鈉乙酸殘留溶劑的檢驗方法，用于控制頭孢噻肟鈉乙酸殘留量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class高效液相色譜儀，Empower 色譜工作站；瑞士Mettler Toledo BP211D XP205分析天平；德國默克Milli-Q IQ7000超純水系統(tǒng)。

1.2 試藥

頭孢噻肟鈉原料藥(批號 100100-1、100100-2、100100-3、100200-1、100200-2、100200-3)；甲醇色譜純；乙酸、磷酸為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbox Edipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5μm)；流動相：量取1mL磷酸和10mL甲醇，用水稀釋到1000mL，用前過濾脫氣；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

乙酸對照溶液: 精密稱定乙酸50mg置100mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度；精密移取該溶液5mL，置25mL容量瓶，用流動相稀釋至刻度，即得。

供試品溶液：精密稱定頭孢噻肟鈉原料100mg置10mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，即得濃度為10 mg·mL-1的供試品溶液。

線性儲備液：精密稱定乙酸50mg置100mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，即得。

空白溶液的配制：用流動相作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取對照溶液20μL 注入液相色譜儀，連續(xù)進樣對照溶液6針。記錄色譜圖，結(jié)果見表 1 及圖 1。本實驗乙酸峰理論塔板數(shù)和乙酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD%)作為系統(tǒng)適用性實驗考察指標(biāo)。乙酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不超過5.0%；乙酸峰理論塔板數(shù)不低于3000。

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig.1 Chromatogram of system suitability

2.4 線性關(guān)系的考察

取線性儲備液適量，加流動相稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.03、0.05、0.1、0.12、0.15、0.2 mg·mL-1的單一成分溶液，取上述溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照斜率法計算各雜質(zhì)的相對校正因子，乙酸的峰面積對濃度線性回歸的相關(guān)系數(shù)為0.9999。Y軸截距在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)，各濃度的響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.4%。試驗結(jié)果見表2及圖2。

表2 線性結(jié)果表

表2(續(xù))

圖2 線性回歸方程Fig.2 Linear Regression equations

2.5 檢測下限與定量下限試驗

取乙酸對照溶液適量，加流動相稀釋制成適當(dāng)濃度的溶液，取 20μL進樣分析。以信噪比 S/N=3為指標(biāo)，重復(fù)進樣6次，進樣濃度為4.0ng·mL-1，即檢測下限為 0.08ng(0.0008%)，RSD為4.6%；以信噪比 S/N=10為指標(biāo)，重復(fù)進樣6次，進樣濃度為20.0 ng·mL-1，即定量下限為0.40 ng(0.004%)，RSD 為 2.9%。

2.6 穩(wěn)定性考察

對照溶液穩(wěn)定性：取乙酸對照溶液，按“2.1”項下的色譜條件，在2～8℃下避光保存放置 0、1、2天，進樣20μL，乙酸含量與0天配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，放置1天和放置2天回收率分別為99.03%和99.11%，對照溶液在兩天內(nèi)穩(wěn)定性良好。

供試品溶液穩(wěn)定性：取供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，在2～8℃下避光保存放置 0、12、24、36、48、60、84、96、108、120、132min，進樣20μL，與0min初始配制的溶液進行比較，計算乙酸的變化率。結(jié)果見表3，供試品溶液雜質(zhì)中的乙酸隨時間延長而增大，放置132min時，乙酸雜質(zhì)增加35.2%。供試品溶液在48min內(nèi)乙酸濃度的變化率小于10.0%。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果表

表3(續(xù))

2.7 重復(fù)性試驗

按“2.2”項下的供試品溶液制備方法，平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，以峰面積計算其 RSD。乙酸峰面積的RSD為3.6% ，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 精密度試驗

進樣精密度：取供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，連續(xù)進樣 6 次，按峰面積計算其 RSD。乙酸峰面積的 RSD 為3.9%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

中間精密度：分別以不同人員(2 人)、不同時間(連續(xù)3 d)、不同儀器(Agilent 1260；Waters 2489 高效液相色譜儀)按重復(fù)性試驗項下方法進行分析。結(jié)果顯示，乙酸峰面積的 RSD均小于 5.0%。表明本方法精密度良好。

2.9 耐用性考察

取供試品溶液，通過改變“2.1”項下的色譜條件，包括流速、柱溫、色譜柱，考察對乙酸測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表 4。乙酸含量回收率在93%～105%范圍內(nèi)。試驗數(shù)據(jù)表明，當(dāng)色譜柱條件發(fā)生變化時，乙酸含量的測量值波動較大，RSD 為6.62%。因此本試驗需嚴(yán)格控制色譜條件，選擇固定的廠家型號的色譜柱，才可保證方法重現(xiàn)性良好。

表4 耐用性考察結(jié)果

表4(續(xù))

2.10 專屬性試驗

2.10.1 溶劑干擾的考察

取對照溶液及空白溶液各20μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對照溶液乙酸出峰時間在3.4 min,空白溶液峰在乙酸峰出峰時間處無干擾。

2.10.2 峰純度試驗

取對照溶液20μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算純度角，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，乙酸峰的純度角小于純度閾值，純度滿足要求。

表5 乙酸峰純度試驗結(jié)果

2.11 樣品檢測

精密稱取供試品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中約含10μg的溶液，作為供試品溶液。分別取對照溶液和供試品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表 6。在檢測的6批樣品中，乙酸含量均小于0.5%，表明本產(chǎn)品的乙酸雜質(zhì)符合要求。

表6 樣品檢驗結(jié)果

3 討論

在溶液穩(wěn)定性實驗中，對照品溶液在2～8℃下避光保存2天內(nèi)保持穩(wěn)定，而供試品溶液在該存儲條件下不穩(wěn)定，建議在測定頭孢噻肟鈉乙酸含量時供試品需要現(xiàn)配現(xiàn)進。

耐用性考察實驗中，改變不同廠家的色譜柱(均是C18 4.6 mm×150 mm，5μm)，乙酸含量的測量值波動較大，RSD 為6.62%，為了確保良好的重現(xiàn)性，建議選擇固定的廠家型號的色譜柱，特別是用于長期穩(wěn)定性考察樣品的分析，更換色譜柱會影響乙酸雜質(zhì)趨勢分析。

通過實際樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)在1.5 倍主峰保留時間以后，沒有雜質(zhì)峰出現(xiàn)，為提高試驗效率，將乙酸的運行時間定為12 min，保證了測定結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)論

本試驗建立了高效液相色譜法測定頭孢噻肟鈉原料乙酸雜質(zhì)含量，并對方法的有效性和檢出能力進行了評價。結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確，可以用于頭孢噻肟鈉原料乙酸雜質(zhì)測定，也可以為該藥制劑的質(zhì)量研究提供參考。