鄒 麗 ，馬 靜 ，2

（1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都 611731； 2.電子科技大學(xué)，四川 成都 611731）

蓮白片是由穿心蓮、白花蛇舌草、石上柏等5味藥材制成的薄膜衣片，具有抗癌、散結(jié)、止痛、止血等作用，臨床常用于絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、肺癌、鼻炎癌等，與放射治療或化學(xué)治療配合使用可縮短療程，加快腫瘤消退。穿心蓮為方中君藥，具有清熱解毒、涼血消腫功效，主要成分為內(nèi)酯類、黃酮類和甾醇類等[1]。穿心蓮內(nèi)酯具有顯著的抗炎消腫作用，在穿心蓮定量分析成分中占有比率較高，可作為本品含量測定的檢測指標(biāo)[2-3]。白花蛇舌草為方中臣藥，具有清熱解毒、消痛散結(jié)功效，具有明顯的抗腫瘤活性[4]，主要成分為黃酮類、有機(jī)酸類、甾醇類、多糖類等[5-6]，其中齊墩果酸的含量較高，鑒別斑點(diǎn)明顯，也常作為白花蛇舌草鑒別的對照品。穿心蓮、白花蛇舌草、石上柏等均含有黃酮類成分，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗腫瘤和抗氧化自由基等活性作用，與蓮白片的藥理功效關(guān)系密切。本研究中建立白蓮片含量測定方法時(shí)將總黃酮作為檢測指標(biāo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ400KDE型臺(tái)式高功率數(shù)控清洗器（功率為40～100 W，工作頻率為40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9625A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；全自動(dòng)薄層鋪板儀（北京思普特科技有限公司）；LB-2D型智能崩解時(shí)限測定儀（上海黃海藥檢儀器銷售有限公司）；XP205DR型電子天平（十萬分之一，Mettler Toledo公司）；LC-20AD型高效液相泵，SPD-20A型紫外檢測器（日本島津公司），美國奧泰SS420X工作站；市售硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；自制硅膠G薄層板（取硅膠G適量，按1份固定相和3份含0.3%羧甲基纖維素鈉的水溶液進(jìn)行混勻，用薄層鋪板器制成 10 cm×20 cm、厚度 0.4 mm的硅膠 G薄層板，晾干，110℃條件下加熱30 min，置干燥器存放）。

1.2 試藥

乙醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷、冰醋酸、磷鉬酸、三氯化鋁、醋酸鈉等(分析純，成都市方舟化學(xué)試劑廠)；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；齊墩果酸對照品（批號為110709-201206），蘆丁對照品（批號為100080-201610），穿心蓮內(nèi)酯對照品（供鑒別用，批號為110797-201609），白花蛇舌草對照藥材（供鑒別用，批號為121183-201605），均購于中國食品藥品檢定研究院；蓮白片（實(shí)驗(yàn)室自制，批號分別為 20170103，20170104，20170105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白花蛇舌草薄層色譜鑒別

取本品適量，去薄膜衣，研細(xì)，取2 g，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理 40 min，濾過，濾液濃縮至 1 mL，作為供試品溶液。取齊墩果酸對照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液；另取白花蛇舌草對照藥材1 g，照供試品溶液制備方法同法制備對照藥材溶液。取蓮白片處方中除白花蛇舌草外的藥材，通過相應(yīng)制備工藝制成陰性對照品，取約2 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。參照2015年版《中國藥典（一部）》[7]通則0502項(xiàng)下方法，精密吸取對照品溶液5 μL、供試品溶液及陰性對照品溶液各 10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（5∶5∶1，V／V／V）為展開劑，上行展開 15 min，取出，晾干，噴10%磷鉬酸乙醇試液，在105℃ 下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液及對照藥材溶液相同位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，Rf值0.3～0.7，斑點(diǎn)分離度良好，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 白花蛇舌草薄層色譜圖

檢視條件考察時(shí)，展開后，分別噴2%三氯化鐵試液或10%磷鉬酸乙醇試液加熱至斑點(diǎn)顯色清晰后于日光下檢視。結(jié)果最佳檢視條件為后者。薄層板選擇時(shí)，分別在市售硅膠G薄層板和自制硅膠G薄層板上點(diǎn)樣并依法展開，結(jié)果兩者的特征斑點(diǎn)均顯色清晰，分離度達(dá)到要求。

2.2 崩解時(shí)限考察

分別取3批樣品各6片，參照2015年版《中國藥典（四部）》[7]通則0921崩解時(shí)限中的方法，在鹽酸溶液（9→1 000）中進(jìn)行崩解時(shí)限考察。結(jié)果表明，3批樣品均于1 h內(nèi)全部崩解，符合相關(guān)規(guī)定。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 溶液制備

取105℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品11.67 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL中含蘆丁1.167 mg）。取蓮白片適量，去包衣，取約3 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷70 mL，回流3 h脫脂，濾過，棄去三氯甲烷，殘?jiān)鼡]干，加甲醇70 mL，再加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。稱取1.5 g無水醋酸鈉，加入50 mL水使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié) pH至4.5 ±0.1，得醋酸 -醋酸鈉緩沖液（pH ＝4.5 ±0.1），備用。稱取0.68 g三氯化鋁，加入50 mL乙醇使溶解，得三氯化鋁溶液 0.102 mol／L（0.1 mol／L），備用。

2.3.2 最大吸收波長確定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置10 mL容量瓶中，依次加入0.1 mol／L三氯化鋁溶液 1 mL 和 pH（4.5±0.1）醋酸 -醋酸鈉緩沖液 1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。取續(xù)濾液置比色皿中，照紫外-可見分光光度法[2015年版《中國藥典》通則0401][7]，在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果上述溶液在415 nm波長處均有最大吸收，故以此為測定波長。光譜圖見圖2。

圖2 紫外可見分光光譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按蓮白片的處方配制缺總黃酮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，進(jìn)行全波長（200～800 nm）掃描測定。結(jié)果陰性對照品溶液在415 nm波長處基本無吸收，表明處方中其他成分對總黃酮測定無干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線考察：精密量取質(zhì)量濃度為1.167 g／L的對照品溶液 0，0.10，0.25，0.50，0.80，1.00，1.20 mL，分別置7個(gè)10 mL容量瓶中，依次加入0.102 mol／L三氯化鋁溶液 1 mL和 pH(4.5±0.1)醋酸 -醋酸鈉緩沖液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置 30 min。按紫外 -可見分光光度法（2015年版《中國藥典》通則0401），以第1管作為空白對照，415 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.014 8 X＋0.153 2，r＝0.999 2（n ＝6）。結(jié)果表明，總黃酮質(zhì)量濃度在 11.67 ～140.04 μg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為1.167 g／L的對照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，依法顯色后測定吸光度。結(jié)果蘆丁對照品吸光度的 RSD為0.42%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，依法顯色，分別在室溫下每隔20 min測定吸光度。結(jié)果吸光度 RSD為0.87%（n＝6），表明供試品溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性較高。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20170103）適量，依法制備供試品溶液，照上述顯色方法測定吸光度。結(jié)果總黃酮的平均含量為 1.947 mg，RSD 為 1.74% （n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的蓮白片（批號為20170103）6份，分別加入質(zhì)量濃度為6.82 g／L的蘆丁對照品溶液各1 mL，依法制備供試品溶液，照上述顯色方法測定吸光度，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3.4 樣品含量測定

取實(shí)驗(yàn)室自制3批樣品，依法制備供試品溶液，照上述顯色方法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出供試品溶液中總黃酮的含量。結(jié)果見表2。

2.4 穿心蓮內(nèi)酯含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -水（45 ∶55，V／V）；流速：1 mL ／min；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長：225 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg，n＝3）

2.4.2 溶液制備

取穿心蓮內(nèi)酯對照品 11.62 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.162 g／L的對照品貯備液；精密量取上述貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.116 2 g／L的對照品溶液；精密量取對照品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為 58.1 μg／mL的對照品溶液。取本品適量，去包衣，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。取蓮白片處方中除穿心蓮?fù)獾钠渌幉?，按制備工藝和供試品制備方法，同法制成陰性對照品溶液?/p>

2.4.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.4.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按擬訂色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相同保留時(shí)間有相關(guān)峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為 58.1 μg／mL和 1.162 g／L 的對照品溶液各 2，5，10 μL，注入高效液相色譜儀，以絕對進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝2 245.1 X-116 134，r＝0.999 8（n＝6）。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.116～11.62 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取質(zhì)量濃度為 58.1 μg／mL的對照品溶液10 μL，依法進(jìn)樣。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯峰面積的 RSD為0.95%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品適量，按擬訂方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12 h 時(shí)測定。結(jié)果的RSD為1.27%(n＝5)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號為20170103），依法制備供試品溶液并測定，計(jì)算含量。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯平均含量為每片 0.383 mg，RSD 為 1.53% （n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖3 高效液相色譜圖

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（批號為20170103，含量為每片 0.191 mg）樣品 6份，去包衣后研成細(xì)粉，各1 g，置 6個(gè)具塞錐形瓶中，每份加入質(zhì)量濃度為1.624 g／L的對照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4.4 樣品含量測定

取3批自制樣品適量（每批平行取2份），依法制備供試品溶液，精密吸取質(zhì)量濃度為58.1 μg／mL穿心蓮對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測定，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 薄層色譜條件

點(diǎn)樣量選擇時(shí)，吸取對照品溶液、供試品溶液各2，5，10，20 μL，點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，依法展開，按斑點(diǎn)清晰度和分離度選擇，結(jié)果最佳點(diǎn)樣量為供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL。展開劑選擇時(shí)，分別以乙酸乙酯 -甲醇 -水（8∶1∶1，V／V／V）[8]、三氯甲烷 -乙醚（5∶l）[9]、甲苯 -丙酮 -乙酸（10∶2∶0.2，V／V／V）[10]和正己烷 -三氯甲烷 -甲醇（5∶5∶1，V／V／V）為展開劑展開并顯色。結(jié)果采用前3種展開劑時(shí)特征斑點(diǎn)出現(xiàn)了分離度不好、拖尾嚴(yán)重、Rf值過高的情況；而最后1種展開劑的斑點(diǎn)分離度較好，斑點(diǎn)顏色清晰，Rf值適中。故以正己烷-三氯甲烷-甲醇（5∶5∶1，V／V／V）為展開劑。

3.2 總黃酮含量測定

提取溶劑：一般提取黃酮類成分時(shí)，常采用30%乙醇、乙醇[11]、60%乙醇[12]為提取溶劑，但本試驗(yàn)中考察發(fā)現(xiàn)，采用低濃度乙醇提取的總黃酮不完全、水溶性雜質(zhì)多；而用乙醇提取總黃酮的水溶性雜質(zhì)雖少，但含有部分脂溶性雜質(zhì)。綜合考慮，蓮白片采用三氯甲烷脫脂除雜，再以甲醇為提取溶劑，可充分提取總黃酮。

提取方法及時(shí)間：分別直接采用超聲波提取1 h、加熱回流提取3 h、索氏連續(xù)回流提取2 h，結(jié)果前兩者的總黃酮含量較低，提取不完全，提取效率較低；而采用后一種方法提取，總黃酮含量高，提取時(shí)間充分，適合作為蓮白片的提取方法。

比色方法：分別采用硝酸鋁顯色法[13]和三氯化鋁顯色法[14]對蓮白片中總黃酮進(jìn)行測定。使用硝酸鋁顯色法時(shí)，蘆丁對照品溶液于500 nm波長處有最大吸收，而供試品溶液于500 nm波長處的吸收較弱，說明蓮白片用此方法測定的專屬性不強(qiáng)，有一定局限性。而采用三氯化鋁顯色法的專屬性較強(qiáng)，在415 nm波長處的干擾小，適合測定蓮白片中的總黃酮。另外，還考察過顯色時(shí)間，從加入顯色劑開始，每隔5 min測1次吸光度，結(jié)果在加入顯色劑后25～35 min時(shí)，吸光度值變化緩慢，無顯著差異，故確定最后的顯色時(shí)間為30 min；三氯化鋁的用量，分別加入了 0.1 mol／L三氯化鋁溶液 0.5，1.0，1.5 mL，同法制成供試品溶液，結(jié)果隨著顯色劑用量的增大，吸光度先增大后縮小，用量在1.0 mL時(shí)吸光度最大。

3.3 穿心蓮內(nèi)酯含量測定

前處理考察：分別以甲醇[15]、40%甲醇[16]和60%甲醇溶液為提取溶劑；用超聲波提取和加熱回流提取為提取方法；以提取15，30，60 min為提取時(shí)間對穿心蓮內(nèi)酯的前處理方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在不同提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間的條件下，供試品溶液中均有與穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液保留時(shí)間一致的峰，但綜合有效成分的含量、分離度、出峰時(shí)間及峰寬等因素考慮，最終選擇以60%甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min。

系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)：分別考察了不同品牌的色譜柱[Shim-pack C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）]，不同柱溫（25，30，35℃），不同的流動(dòng)相條件[甲醇-水梯度洗脫[17]、甲醇-水（65 ∶35，V／V）[18]和甲醇 -水（45 ∶55，V／V）]的差異。結(jié)果表明，在不同品牌的色譜柱、不同比例的流動(dòng)相及不同柱溫條件下，供試品溶液中均有與穿心蓮內(nèi)酯對照品保留時(shí)間一致的峰，說明該色譜條件的系統(tǒng)適用性良好；但從出峰時(shí)間、分離度、理論板數(shù)、基線波動(dòng)、試驗(yàn)效率等因素的影響來考慮，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55，V／V）時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯與其他組分的分離度達(dá)到要求[分離度(R)≥1.5]，色譜峰峰形對稱而尖銳[拖尾因子(T)為 1.01]，故確定流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55，V／V），柱溫為 35℃。