閔 紅，楊曉莉，賀聰瑩，繩金房

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

藥物制劑在正常儲存和使用過程中面臨著污染與變質(zhì)的風(fēng)險，如果藥物本身不具有充分的抑菌活性，就應(yīng)根據(jù)制劑特性添加適宜的抑菌劑，防止藥物變質(zhì)。所有抑菌劑都具有一定毒性，用量過多會對人類造成危害，故制劑處方中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。丙泊酚乳狀注射液是一種適用于誘導(dǎo)和維持全身麻醉的短效靜脈麻醉劑，自臨床廣泛使用以來，陸續(xù)出現(xiàn)與之相關(guān)的感染和發(fā)熱情況[1-3]。分析原因，丙泊酚乳狀注射液本身支持微生物生長，臨床不嚴(yán)格操作或未準(zhǔn)確根據(jù)處方信息使用，導(dǎo)致外源微生物污染，引起感染和發(fā)熱[4]。乙二胺四乙酸(EDTA)能螯合微生物生長所需的金屬元素，如 Ca2＋及 Mg2＋等，具有一定的抑菌作用，還能去除細(xì)菌含脂多糖的外壁層，溶解類脂化合物，特別是脂肪酸，可增加對化學(xué)防腐劑的敏感性。為了減少微生物污染風(fēng)險，本研究中考察了加入低濃度的EDTA（0.005%）后丙泊酚乳狀注射液的抑菌性[5]，同時比較了低硼硅玻璃安瓿和中硼硅玻璃安瓿包裝材料對丙泊酚乳狀注射液抑菌效力的差異性。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

臥式矩形壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器公司）；HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（天津鑫博得儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱、LRH-250F型霉菌培養(yǎng)箱均購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.2 材料

菌株：金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus[CMCC（B）26003]、銅 綠 假 單 胞 菌 Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B)10104]、大腸埃希菌 Escherichia coli[CMCC（B）44102]、白 色 念 珠 菌 Candida albicans[CMCC（F）98001]、黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC（F）98003]，上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

培養(yǎng)基及稀釋液：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為171120），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為 180108），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為170329），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號為160316），以上培養(yǎng)基均來自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20170621）。

試藥與包裝：丙泊酚乳狀注射液（西安力邦制藥有限公司，規(guī)格每支 20 mL∶0.2 g），添加低濃度 EDTA（0.005%）；低硼硅玻璃安瓿簡稱丙泊酚乳狀注射液（低硼硅），中硼硅玻璃安瓿簡稱丙泊酚乳狀注射液（中硼硅）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3 d。上述培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng) 7 d，加入 5 mL含 0.05%的聚山梨酯 80的無菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.1.2 計數(shù)方法適用性試驗

計數(shù)方法適用性試驗分組分為試驗組、供試品對照組和菌液對照組，并進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗。試驗組取供試液原液分裝于5個無菌試管中，各9.9 mL，再分別加入含菌量不大于104 cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1 mL，混勻。供試品對照組取供試液原液9.9 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基0.1 mL，混勻。菌液對照組取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗組操作，分別加入含菌量不大于104 cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1 mL，混勻。

取制備好的試驗組樣品液1 mL，置直徑為90 mm的無菌平皿中，注入溫度不超過45℃熔化的培養(yǎng)基約20 mL，其中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌和黑曲霉注入沙氏葡萄糖瓊脂，混勻，凝固，按規(guī)定條件倒置培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組的菌數(shù)。計算各組的平均菌落數(shù)。

方法適用性試驗各試驗菌回收率（%）＝（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)

方法適用性試驗各試驗菌回收率不得低于50%，若回收率低于50%，需繼續(xù)進(jìn)行方法適用性試驗，直至消除供試品的抑菌性。

2.1.3 抑菌效力測定試驗

供試品接種：取包裝完整的供試品5份，無菌打開，取出 0.2 mL供試液，分別直接接種含菌量約為108 cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.2 mL，充分混勻，置25℃避光貯存。

初始（0 h）活菌數(shù)測定：取等量菌液加入 19.8 mL無菌0.9%氯化鈉溶液，混合均勻，取菌懸液1 mL加入9 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，混勻，制成1∶10的菌懸液。取適宜稀釋級菌懸液1 mL，置直徑為90 mm的無菌平皿中，注入15～20 mL溫度不超過45℃的培養(yǎng)基，測定初始（0 h）活菌數(shù)，并將菌數(shù)換算成lg值。

規(guī)定間隔時間存活菌數(shù)測定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的時間段，采用供試品適用性試驗確定的方法，檢測每份供試品中所含各試驗菌的活菌數(shù)量及供試品本底數(shù)量，并將菌數(shù)換算成lg值。

2.2 結(jié)果

由表1可見，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均不低于50%，符合2015年版《中國藥典》抑菌效力檢查法規(guī)定，最低稀釋級可取供試液原液1 mL傾注平皿（直徑90 mm）對樣品進(jìn)行細(xì)菌和真菌計數(shù)。

由表2可見，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉在規(guī)定間隔時間“減少的lg值”未達(dá)到注射劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，丙泊酚乳狀注射液（低硼硅、中硼硅）抑菌效力均不符合2015年版《中國藥典》抑菌效力檢查法的規(guī)定。丙泊酚乳狀注射液（中硼硅）貯存6 h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌對數(shù)減少值與丙泊酚乳狀注射液（低硼硅）分別相差 0.2lg，0lg，-0.1lg 值，貯存 7 d 分別相差 0.4lg，0.2lg，0lg 值；丙泊酚乳狀注射液（中硼硅）貯存 6 h，白色念珠菌和黑曲霉對數(shù)減少值與丙泊酚乳狀注射液（低硼硅）分別相差 0.1lg，-0.2lg 值，貯存 7 d 分別相差0.1lg，-0.1lg值。本試驗結(jié)果說明，中硼硅和低硼硅玻璃安瓿2種包裝材料的丙泊酚乳狀注射液的抑菌效力無顯著差異。

表1 細(xì)菌和真菌計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果（%）

表2 丙泊酚乳狀注射液抑菌效力檢查結(jié)果(低硼硅／中硼硅)

3 討論

3.1 低濃度EDTA丙泊酚乳狀注射液抑菌效力評價

本試驗結(jié)果表明，添加低濃度EDTA（0.005%）丙泊酚乳狀注射液抑菌效力不符合2015年版《中國藥典》抑菌效力檢查法（通則1121）規(guī)定，但仍有一定的抑菌效力，隨著貯存時間的延長，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉數(shù)量均呈下降趨勢，表明添加低濃度 EDTA（0.005%）的丙泊酚乳狀注射液對革蘭陽性、革蘭陰性、霉菌和酵母菌均有一定抑制作用。使用含低濃度 EDTA（0.005%）的丙泊酚乳狀注射液，術(shù)后感染和發(fā)熱現(xiàn)象均顯著下降[4]，進(jìn)一步證明低濃度EDTA（0.005%）的添加對微生物生長和繁殖具有一定抑制作用。

2015年版《中國藥典》0100制劑通則規(guī)定，多劑量包裝注射液需添加適宜的抑菌劑，抑菌效力應(yīng)符合抑菌效力檢查法（通則1121）規(guī)定。對于單劑量包裝注射液中添加抑菌劑未做要求，但單劑量包裝注射液在臨床使用過程不嚴(yán)格操作仍會存在污染風(fēng)險，添加低濃度EDTA（0.005%）可有效排除其使用過程微生物污染隱患。對于多劑量包裝注射液，由于1個包裝多次頻繁使用，暴露于空氣中的時間較長，低濃度 EDTA（0.005%）的添加不能有效排除微生物污染隱患。

3.2 抑菌劑效力檢查法注意事項解析

2010年版《中國藥典》收載了抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則，2015年版修訂為1121抑菌效力檢查法，由從針對抑菌劑的檢查到針對產(chǎn)品本身抑菌性的檢查，定位更準(zhǔn)確[6]。國內(nèi)部分企業(yè)對藥品處方中抑菌劑的添加及抑菌效力的檢查試驗，多依據(jù)文獻(xiàn)資料和使用經(jīng)驗確定，對于通過“抑菌效力檢查法”科學(xué)評估抑菌效力，篩查出抑菌劑添加的最低有效量仍屬空白；部分企業(yè)根據(jù)2015年版《中國藥典》抑菌效力檢查法開展了抑菌效力評價試驗，但對于試驗中部分內(nèi)容理解不到位，本研究中總結(jié)出了抑菌效力檢查法注意事項，并進(jìn)行了解析。

1）抑菌效力檢查試驗首先需做該藥物制劑的方法學(xué)適用性研究。為確保其試驗菌的充分檢出，應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗。若產(chǎn)品的抑菌性較強(qiáng)，可采用增加稀釋液和培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、薄膜過濾法，直至方法適用性試驗通過。只有方法適用性試驗回收率≥50%[7-9]，該方法才能用于抑菌效力檢查存活菌數(shù)測定試驗。

2）只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同時容器便于按無菌操作技術(shù)接入試驗菌液、混合、取樣和封口等，應(yīng)將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進(jìn)行試驗。如果容器的材質(zhì)可能影響供試品的特性，如吸附作用和pH等，必須在原包裝中進(jìn)行試驗。本研究中考查了中硼硅和低硼硅玻璃安瓿2種包裝材料對藥物制劑抑菌效力的影響，因此是在原包裝中進(jìn)行試驗。試驗結(jié)果表明，中硼硅和低硼硅玻璃安瓿2種包裝材料對丙泊酚注射液的抑菌效力幾乎無影響。

3）除可選擇金黃色葡萄球菌（革蘭陽性菌）、大腸埃希菌（發(fā)酵型革蘭陰性菌）、銅綠假單胞菌（非發(fā)酵革蘭陰性性菌）、白色念珠菌（酵母菌）和黑曲霉（霉菌）作為抑菌效力檢查的試驗菌株[10]外，還可選擇潛在的對該藥物制劑安全性和／或有效性造成不利影響的污染微生物和環(huán)境微生物[7]。

4）抑菌效力檢查初始（0 h時）菌數(shù)對于結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要。很多試驗均將0 h時定義為“與樣品剛接觸時”，而肖璜等[11]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌在剛接觸醋酸苯汞（抑菌劑）時瞬間被殺滅，將0 h時規(guī)定為“添加菌液的原始濃度”更具科學(xué)性和可操作性。中國、日本、美國、歐洲的藥典[5，7-9]均將0 h時定義為“添加菌液的原始濃度”。具體操作過程：取等量菌液接入與供試品等體積的無菌0.9%氯化鈉溶液中，均勻混合，取該混合菌懸液1 mL，加入9 mL與方法適用性試驗相同的稀釋液，混勻，制成1∶10的菌懸液。取適宜稀釋級的菌懸液1 mL置無菌平皿中，注入15～20 mL溫度不超過45℃的培養(yǎng)基，測定初始活菌數(shù)，并將菌數(shù)換算成lg值。

3.3 抑菌效力評價的意義及發(fā)展趨勢

如何選擇抑菌劑及如何實(shí)現(xiàn)抑菌劑添加的最低有效量，仍是抑菌效力檢查的難點(diǎn)，抑菌劑添加過量會對人體危害，添加不足會增加藥物制劑微生物污染的風(fēng)險。目前，國內(nèi)藥物制劑存在抑菌劑隨意添加、過量添加及添加不足等亂象[12-13]。同一企業(yè)不同批次復(fù)方醋酸地塞米松乳膏抑菌劑添加量相差1倍以上，不同廠家抑菌劑添加量也不同，說明廠家對合理使用抑菌劑的主觀重視度不夠，理解不到位[14]。

抑菌劑的正確選擇與合理使用需根據(jù)藥品特性、抑菌劑的抗菌特性、貯藏條件等因素選擇適宜的抑菌劑，通過抑菌效力檢查試驗，篩選出抑菌劑添加的最低有效量，合理使用抑菌劑，確保產(chǎn)品安全、有效和穩(wěn)定[15]。建議國內(nèi)對上市藥物制劑的抑菌劑添加情況進(jìn)行調(diào)研，開展上市產(chǎn)品抑菌效力抽驗工作，全面了解抑菌劑添加情況，建立抑菌效力數(shù)據(jù)庫，為企業(yè)處方添加和政府有效監(jiān)管提供支持，為消費(fèi)者提供可放心使用的藥物制劑。