王景靚，徐曉峰，張家國

（遼寧省大連市第二人民醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116011）

類風濕關節(jié)炎（RA）屬常見自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為多個關節(jié)滑膜的炎癥、增生等，如不及時有效地治療，隨著病情的不斷進展，會出現(xiàn)不同程度的關節(jié)畸形及活動功能障礙[1]。近年來，中醫(yī)藥低毒性及多靶點治療的特點越來越受到重視，已成為研發(fā)治療RA藥物的新靶點[2]。風濕定膠囊具有補氣養(yǎng)血、扶正祛邪、驅寒除濕等功效，能治療RA及坐骨神經(jīng)痛等病癥，其作用機制可能與其能調(diào)節(jié)Janus激酶／信號轉導子與轉錄激活子（JAK ／STAT）信號通路有關[3]。JAK ／STAT 信號通路屬諸多細胞因子發(fā)生信號轉導的一個共同途徑，能廣泛地參與到細胞增殖、分化、凋亡，以及機體的炎性反應過程，并能依靠負調(diào)節(jié)因子同其他信號通路發(fā)生相互作用，還可通過STATs的共價修飾途徑實施信號調(diào)節(jié)。此信號通路能促使各類炎癥類疾病的形成和發(fā)展，對其實施靶向治療逐漸成了當前研究的重要方向。本研究中探討了風濕定膠囊治療RA的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：SPF級健康未交配性成熟的雄性Wistar大鼠100只，體質量為 180～220g，足趾容積為 1.70～2.30mL，購自廣州中醫(yī)藥大學，動物合格證號為 SYXK（粵）2014-0144，予以標準飼料和水飼養(yǎng)，保證生存室溫為18～22℃，相對濕度為40% ～50%。本試驗經(jīng)醫(yī)院試驗動物倫理委員會審批。

試藥：風濕定膠囊（陜西健民制藥有限公司，國藥準字 Z20044165，規(guī)格為每粒 0.3 g）；Ⅱ型膠原（規(guī)格為每支10 mg），完全弗氏佐劑，均購自大連寶生物工程有限公司。

儀器：總RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司)；p-JAK3及p-STAT3單抗購自上海康朗生物科技有限公司；熒光定量PCR儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；Western Blotting相關試劑盒（上海英拜生物科技有限公司）。

1.2 方法

動物分組：根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組，分別為空白對照組(A組)，模型組(B組)，風濕定膠囊低、中、高劑量組(C1組，C2組，C3組)，每組 20 只。

風濕定膠囊灌胃溶液配制：按照不同劑量取風濕定膠囊加入0.9%氯化鈉注射液中，制成混懸液，低、中、高劑量分別為 10，20，40 g／L，給藥體積為每 100 g體質量2 mL。大鼠的風濕定膠囊灌胃濃度根據(jù)體表面積法，以臨床成人給藥劑量計算。

CⅡ乳劑配置：無菌條件下用0.1 mol／L冰乙酸充分溶解Ⅱ型膠原，隨后置4℃冰箱過夜。于次日取出，加入等體積完全弗氏佐劑混合，經(jīng)振蕩乳化得CⅡ乳劑，置4℃冰箱保存。

RA模型大鼠制備：采用10%水合氯醛麻醉處理，選擇大鼠背部及左右足跖多點皮下注射0.5 mL CⅡ乳劑。A組與B組予等量生理鹽水，C1組，C2組，C3組分別予200，400，800 mg／（kg·d）的風濕定膠囊，連續(xù)給藥 4 周。

p-JAK3及p-STAT3蛋白表達水平檢測：提取各組大鼠的關節(jié)滑膜組織，置研缽內(nèi)，添加300 μL的裂解液，研磨10 min，再充分振蕩后放置10 min，4℃下以14 000 r／min離心 10 min，獲得上清總蛋白，通過 BCA法測定蛋白濃度，再提取適量的總蛋白，通過5倍的上樣緩沖液稀釋后，置95℃條件下5 min。再將變性蛋白置120 g／LSDS-PAGE內(nèi)實施電泳，并添入一抗 p-JAK3和p-STAT3，4℃下與辣根過氧化酶發(fā)生結合的山羊抗兔共同孵育過夜，通過BeyoECL Plus發(fā)光測定，完成后清除免疫印跡，測定甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，有關操作步驟同上。利用圖像分析軟件對條帶實施灰度分析，將二者的蛋白灰度比記為表達水平。

1.3 觀察指標

比較給藥后 0，7，14，21，28 d 時各組大鼠的體質量與足部腫脹體積變化情況，對比給藥4周后各組大鼠的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理。計數(shù)資料以率（%）表示，行 χ2檢驗。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗；多組間的計量資料比較實施方差分析，計算 F值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

結果見表1和表2及圖1。

表1 各組大鼠不同時間點體質量和足部腫脹體積比較（X±s，n＝20）

表2 各組大鼠滑膜組織中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平比較（s，n＝20）

表2 各組大鼠滑膜組織中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平比較（s，n＝20）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值p-JAK3蛋白0.59 ± 0.04＃1.90 ± 0.15 1.31 ± 0.12＃1.15 ± 0.11＃0.87 ± 0.07＃7.885 0.000 p-STAT3蛋白0.68 ± 0.13＃2.76 ± 0.21 1.70 ± 0.18＃1.33 ± 0.12＃0.93 ± 0.10＃10.691 0.000

圖1 各組大鼠滑膜組織中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平

3 討論

RA患者普遍存在不同程度的關節(jié)功能障礙，加之免疫系統(tǒng)失調(diào)，極易導致感染性疾病及心血管疾病[4-5]。目前，臨床主要采用激素類藥物治療，但長期服用極易引發(fā)不良反應，降低患者的依從性及耐受性，不利于預后[6]。RA中醫(yī)治療主要是從病機根源“痹病”出發(fā)，辨證施治，且以扶正驅邪為主要原則。目前，中醫(yī)針對RA的治療常用有清熱解毒、活血化瘀、祛風散寒等功效的復方藥，雖然臨床療效明顯，但其具體的作用機制尚未完全明確。

本研究結果顯示，A組和風濕定膠囊給藥組大鼠于7，14，21，28 d時的體質量均比B組高，且隨著風濕定膠囊劑量的不斷增加呈逐漸增長趨勢。風濕定膠囊方中，甘草清熱解毒、補氣益脾、和中緩急，八角楓祛風除濕、散瘀止痛、舒筋活絡，徐長卿祛風止痛、止癢消腫，白芷祛風除濕、活血排毒、生肌止痛，諸藥聯(lián)用，共奏鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫及活血通絡功效，可有效改善RA的預后。A組和風濕定膠囊給藥組大鼠7，14，21，28 d時的足部腫脹體積均比B組低，且隨著風濕定膠囊劑量的不斷增加而逐漸降低，表明風濕定膠囊有利于降低大鼠的足部腫脹體積，主要原因與風濕定膠囊能有效改善關節(jié)滑膜組織增生、炎癥有關。

A組和風濕定膠囊給藥組大鼠滑膜組織中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平均比B組低，且隨著風濕定膠囊劑量的不斷增加而呈逐漸降低趨勢，這與文獻[7-8]報道相符，提示風濕定膠囊可有效降低RA大鼠滑膜組織中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平與其能調(diào)節(jié)Janus激酶／信號轉導子與轉錄激活子（JAK ／STAT）信號通路等因素有關。JAK ／STAT 信號通路是哺乳動物機體中較常見的一種信號轉導途徑，通常含有4個JAKs及7個STATs，其中JAKs屬非受體類酪氨酸激酶，主要有 JAK1，JAK2，JAK3，Tyk2 等成員，相對JAK3存在7個保守性結構域，不含跨膜結構域，其C-末端的JH1和JH2域存在催化功能，而N-末端所含4個JH域不存在酪氨酸激酶的活性，但可能參與到JAKs和其他有關的信號蛋白分子互相結合過程[9-11]。STATs源自研究干擾素的信號轉導機制過程，其主要包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，5aSTAT，5bSTAT，STAT6等成員。STAT3是常見的家族蛋白成員，其所含有的C-末端殘基構成了轉錄激活域，并與其他STATs成員間具有較大差異，因此可促使其與RA有關的其他轉錄調(diào)節(jié)信號發(fā)生聯(lián)系[12-13]。此信號通路是人體內(nèi)重要的多功能細胞因子轉導通路，參與了體內(nèi)細胞增殖分化、炎性反應、免疫調(diào)節(jié)等多種病理生理過程，并與RA的發(fā)生及進展有關。研究發(fā)現(xiàn)，RA大鼠治療后關節(jié)滑膜組織中的 JAK3及 STAT1等均存在顯著降低[14]。風濕定膠囊可能正是通過下調(diào)組織滑膜中的p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平調(diào)控JAK／STAT信號通路，發(fā)揮治療RA的作用。

綜上所述，風濕定膠囊治療RA模型大鼠的可能機制為下調(diào)組織滑膜中p-JAK3和p-STAT3蛋白表達水平，參與JAK／STAT信號通路的調(diào)控過程，進一步發(fā)揮治療作用。