應(yīng) 敏 ，王 穎 ，劉金坤

（1.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院·重慶市腫瘤研究所·重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶 400030； 2.重慶市中醫(yī)院·中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究室，重慶 400021； 3.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，可發(fā)生于任何年齡[1]。以往的研究認(rèn)為，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的失衡促進(jìn)自身免疫、炎癥和關(guān)節(jié)破壞是RA的主要誘因，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎、血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[2]，可并發(fā)肺部疾病、心血管疾病、惡性腫瘤及抑郁癥等[3]。RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。蠲痹湯出自清代程國(guó)彭《醫(yī)學(xué)心悟》，“通治風(fēng)、寒、濕三氣，合而成痹”，本方具有祛風(fēng)、除濕、散寒、活血、通絡(luò)、止痛之功效，是臨床治療風(fēng)寒濕痹的常用方劑。方中羌活、獨(dú)活、桂枝、秦艽、海風(fēng)藤祛風(fēng)、除濕、散寒，輔以當(dāng)歸、川芎、乳香、木香、桑枝、甘草理氣活血、養(yǎng)血通絡(luò)，全方溫而不燥烈，通而不傷正。近年來(lái)，以蠲痹湯為基本方隨證加減，已擴(kuò)展到臨床多種疾病的治療，并獲得滿意效果[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在疾病-靶點(diǎn)-藥物的多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上，用于從整體上預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)、提高藥物發(fā)現(xiàn)效率[5]，并逐漸在中藥研究中得到廣泛應(yīng)用。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究了蠲痹湯治療RA的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 蠲痹湯的化學(xué)成分

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http：／／lsp.nwu.edu.cn ／tcmsp.php）[6]檢索蠲痹湯全方羌活、獨(dú)活、桂枝、秦艽、海風(fēng)藤、桑枝、當(dāng)歸、川芎、乳香、木香、甘草的所有化學(xué)成分，共搜集1 412個(gè)化合物，其中羌活185個(gè)，獨(dú)活99個(gè)，桂枝220個(gè)，秦艽27個(gè)，海風(fēng)藤31個(gè)，桑枝23個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，川芎189個(gè)，乳香127個(gè)，木香106個(gè)，甘草280個(gè)。

1.2 口服生物利用度（OB）和類(lèi)藥性（DL）篩選

蠲痹湯處方藥材的化合物OB和DL篩選閾值分別為 OB≥30% ，DL≥0.18。通過(guò)篩選，1 412 個(gè)化合物分子中有146個(gè)符合條件，并將其作為候選化合物。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通 過(guò) 檢 索 GeneCard 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （https：／／www.genecards.org／）[7]，發(fā)現(xiàn) RA 靶點(diǎn) 3 653 個(gè)，根據(jù)評(píng)分排名前5的靶點(diǎn)分別是白細(xì)胞介素6(IL-6)、人類(lèi)白細(xì)胞抗原組織相容復(fù)合物DRβ1(HLA-DRβ1)、腫瘤壞死因子(TNF)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)、IL-10。將蠲痹湯的處方藥材、化合物、靶點(diǎn)和RA通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件（http： ／／www.cytoscape.org／）[8]構(gòu)建處方-活性化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，以探究蠲痹湯治療RA的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將蠲痹湯相關(guān)靶點(diǎn)基因上傳至 String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／string-db.org）[9]，本研究中選取的是評(píng)分值高于 0.9最高置信度的數(shù)據(jù)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因所表達(dá)。

1.5 基因本體（GO）功能富集京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析

為了說(shuō)明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究中采用Rversion 3.5.2軟件（https： ／／www.r-project.org／） clusterProfiler富集分析包[10]對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。同時(shí)，采用 Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／metascape.org ／）[11]進(jìn)行在線分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

為了提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究中挑選TCMSP平臺(tái)中OB和DL都較高的化合物，以及已有文獻(xiàn)報(bào)道的活性化合物進(jìn)行分析，共篩選出活性化合物146個(gè)。

2.2 蠲痹湯化合物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用11味藥材、146個(gè)化合物與213個(gè)靶點(diǎn)，其中包括與RA共有的148個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建處方-化合物-靶點(diǎn)-疾病。在互作網(wǎng)絡(luò)中，包括371個(gè)節(jié)點(diǎn)（11味藥材，146個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和213個(gè)靶點(diǎn)，1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)）和1 909條邊，詳見(jiàn)圖 1。其中，1個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選Degree較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些連接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用，可能是關(guān)鍵的化合物或靶點(diǎn)。部分處方-化合物-靶點(diǎn)-疾病的關(guān)系見(jiàn)表1。網(wǎng)絡(luò)中，蠲痹湯中存在1個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)之間的相互作用，同時(shí)也存在不同化合物共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了蠲痹湯多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制，同時(shí)也符合中藥復(fù)方的特點(diǎn)。提取蠲痹湯與RA的共有作用靶點(diǎn)，分析藥材成分與靶點(diǎn)間的關(guān)系。從化合物的角度，有4個(gè)化合物的作用靶點(diǎn)≥30個(gè)，MOL000098（quercetin， 槲 皮 素 ）、 MOL000358（betasitosterol，β -谷 甾 醇 ）、MOL000422（kaempferol，山 柰酚）、MOL000449（stigmasterol，豆固醇），分別對(duì)應(yīng) 104，85，72，30個(gè)靶點(diǎn)蛋白。對(duì)于靶點(diǎn)蛋白，Degree≥ 50個(gè)的有 8個(gè)，分別為雌激素受體 1（estrogen receptor 1，ESR1，88 個(gè)）、ESR2（53 個(gè)）、細(xì)胞周期蛋白（cyclin A2，CCNA2，55 個(gè)）、糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B，57 個(gè)）、一氧化氮合成酶 2（nitric oxide synthase 2，NOS2，67 個(gè)）、雄激素受體（androgen receptor，AR，71 個(gè)）、前列腺素 G ／H 合酶 1（prostaglandin G ／H synthase 1，PTGS1，71 個(gè)）、PTGS2（133 個(gè)）。

表1 處方藥材-化合物-靶點(diǎn)-疾病的關(guān)系

圖1 處方中藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蠲痹湯靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為了更好地理解蠲痹湯的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系，利用String軟件構(gòu)建了蠲痹湯靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2）。PPI網(wǎng)絡(luò)包含213個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，870條相互作用關(guān)系（連線）平均節(jié)點(diǎn)度為 8.17，局部聚類(lèi)系數(shù)為0.467。Degree≥ 20 的節(jié)點(diǎn)包括 ESR1（20 個(gè)）、維甲酸受體 -α（retinoic acid receptor-alpha，RXRA，20 個(gè)）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA，20個(gè)）、絲分裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK 8，21 個(gè)）、IL-6（23 個(gè)）、轉(zhuǎn)錄因子 p65（transcription factor p65，RELA，26 個(gè)）、轉(zhuǎn)錄因子 AP（transcription factor AP-1，JUN，28 個(gè)）、TNF（31 個(gè)）、絲氨酸 ／蘇氨酸蛋白激酶 1（alpha serine ／threonine-protein kinase，AKT1，36 個(gè)）。其中，IL-6 和 TNF在RA的疾病靶點(diǎn)中起著重要作用。

2.4 GO富集與KEGG通路富集分析

采用ClusterProfiler包富集分析功能，對(duì)蠲痹湯PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的213個(gè)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了研究。在PATHWAY富集分析中，確定了141個(gè)通路（P＜0.001，圖3 A根據(jù) P值列出前15個(gè)），本研究中與RA相關(guān)的通路有糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、IL-17、TNF、輔助 T 細(xì)胞17（helper T-cells 17，Th17）細(xì)胞分化、MAPK 細(xì)胞信號(hào)通路等（見(jiàn)表 2），分別有 35，27，28，24，33 個(gè)基因富集在以上信號(hào)通路中。GO功能分析中生物過(guò)程相關(guān)的條目1 685個(gè)，涉及脂多糖代謝、氧化應(yīng)激、類(lèi)固醇代謝、血液循環(huán)、對(duì)腫瘤壞死因子的調(diào)控等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目62個(gè)，涉及細(xì)胞膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、神經(jīng)突觸、網(wǎng)格蛋白包被的囊泡、血小板等方面；分子功能相關(guān)的條目129個(gè)，涉及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，類(lèi)固醇激素受體、G蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素受體、血紅素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體、乙酰膽堿受體、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、TNF受體超家族結(jié)合等方面（見(jiàn)圖3），Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶點(diǎn)富集通路和功能得到類(lèi)似結(jié)果（見(jiàn)圖4），表明蠲痹湯通過(guò)以上生物過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞組成，從而發(fā)揮相關(guān)的分子功能。

表2 蠲痹湯中與類(lèi)RA的相關(guān)通路及基因

圖2 蠲痹湯靶點(diǎn)蛋白之間的互作關(guān)系分析

3 討論

蠲痹湯可祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛，主治風(fēng)寒濕三氣合而成痹者，具有益氣活血之功效，氣通則血活，血活則風(fēng)散。由于方中成分眾多，需要整體、系統(tǒng)地對(duì)其機(jī)制進(jìn)行分析，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)是比較合適的研究途徑。

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)主要來(lái)源于DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，具有較高的可信度[6]?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示蠲痹湯中含有的眾多成分及成分相關(guān)的靶點(diǎn)，揭示了復(fù)方中藥多成分、多靶點(diǎn)的內(nèi)涵。蠲痹湯篩選后的活性成分包括146個(gè)化合物，可在體內(nèi)作用于213個(gè)靶點(diǎn)，其中包括與RA共有的148個(gè)靶點(diǎn)（占69.48%）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，蠲痹湯的活性成分中含有較多的黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物。方中桂枝、桑枝、甘草總黃酮、川芎總皂苷、羌活總皂苷、獨(dú)活總皂苷等均對(duì)RA有較好的防治作用[12]，參與調(diào)控 IL-6，TNF，IL-10，IL-1β，轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子 β1（transforming growth factor beta-1，TGF- β1）、C 反應(yīng)蛋白（c-reactive protein，CRP）、基質(zhì)金屬蛋白酶 3（matrix metallopeptidase 3，MMP3）、趨化因子 2（chemokine receptortype2，CCL2）、γ 干擾素（interferon gamma，IFN-γ）、MMP1、白細(xì)胞介素 8（interleukin-8，CXCL8），IL-1α等靶點(diǎn)。黃酮類(lèi)化合物具有明顯清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗炎、抗突變等功能，所含槲皮素、谷甾醇和山柰酚具有抗氧化、抗癌和抗誘變活性作用[13]。另外，羌活、獨(dú)活、當(dāng)歸、川芎中的 7-羥基香豆素（7-hydroxycoumarin）、5，7- 二 甲 氧 基 香 豆 素 （5，7-dimethoxycoumarin）、 紫 花 前 胡 內(nèi) 酯 （nodakenetin）、 阿 魏 酸（ferulicacid）、異歐前胡素（isoimperatorin）等揮發(fā)油、香豆素、酚酸類(lèi)及倍半萜類(lèi)等物質(zhì)群作用于內(nèi)源性過(guò)氧化物合酶PTGS1及PTGS2，轉(zhuǎn)錄因子JUN及STAT1等靶點(diǎn)，提示黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、香豆素類(lèi)、酚酸類(lèi)及倍半萜類(lèi)成分可能是蠲痹湯治療RA的有效物質(zhì)群。

圖3 KEGG通路富集和GO功能分析

目前認(rèn)為，RA的發(fā)病機(jī)制發(fā)生與免疫紊亂、遺傳易感因素和環(huán)境因素等多因素共同影響有關(guān)，尤其與免疫方面關(guān)系最為密切，細(xì)胞因子、Th1／Th2細(xì)胞平衡、細(xì)胞凋亡、激素調(diào)節(jié)、原癌基因等在RA的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[14]。在KEGG信號(hào)通路中，發(fā)現(xiàn)AGERAGE信號(hào)通路中的RAGE受體是晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）的多配體受體[15]。RAGE在許多免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞[16]。RAGE在各種疾?。≧A、炎性腎病、動(dòng)脈硬化）的炎性病變中上調(diào)，具有結(jié)合促炎配體的能力，阻斷RAGE會(huì)阻止中樞炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)的延遲[17]，表明RAGE是免疫／炎性反應(yīng)的重要參與者。

生物制劑用于阻斷細(xì)胞因子如 TNF-α，IL-1，IL-6在治療RA中的作用已被臨床證實(shí)。TNF具有引發(fā)或直接介導(dǎo)白細(xì)胞活化、黏附和遷移、內(nèi)皮活化和血管生成、趨化因子表達(dá)、基質(zhì)細(xì)胞活化、軟骨細(xì)胞活化、激活破骨細(xì)胞的作用。特異性阻斷TNF的臨床研究表明，TNF還介導(dǎo)其他作用：如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，改變認(rèn)知，抑郁和疲勞；在代謝中，通過(guò)改變的膽固醇抑制和胰島素受體抗性；在脈管系統(tǒng)中，可直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能障礙。在局部滑膜環(huán)境中，IL-6介導(dǎo)的作用與TNF相似，具有直接驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)的附加作用。與TNF相比，IL-6似乎也提供了與脂質(zhì)代謝更廣泛的整合。IL-6具有免疫調(diào)節(jié)作用，在早期T細(xì)胞分化為促炎性Th17細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（TREG）的通路中起檢查點(diǎn)作用。在血清陽(yáng)性 RA 中，IL-17，IL-6，STAT3，NF-κB 的失調(diào)與自身免疫疾病產(chǎn)生密切相關(guān)[18]。

IL-17針對(duì)細(xì)胞外細(xì)菌和真菌感染的會(huì)引發(fā)保護(hù)作用，但當(dāng)過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，其會(huì)導(dǎo)致與許多炎癥和自身免疫疾病相關(guān)的慢性炎癥。IL-1和TNF-α通過(guò)滑膜成纖維細(xì)胞驅(qū)動(dòng)MMPs的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥并促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的侵襲，而IL-1和IL-17將軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為降解的表型，從而導(dǎo)致軟骨破壞[19-20]。類(lèi)似的，TNF-α和IL-17誘導(dǎo)破骨細(xì)胞早期分化所需的M-CSF的產(chǎn)生，并且與 IL-1，IL-6和前列腺素 E2（PGE2）一起上調(diào)核因子的受體活化劑[21-23]。

圖4 Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶點(diǎn)富集通路和功能

Th17細(xì)胞是一種能分泌IL-17的T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要意義。TGF-β，IL-6，IL-23，IL-21 在 Th17細(xì)胞的分化形成過(guò)程中起著積極的促進(jìn)作用，而IFN-γ、IL-4、細(xì)胞因子信號(hào)傳送阻抑蛋白3（Socs3）和IL-2則抑制它的分化[24]。MAPK在這些促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和破壞的下游信號(hào)傳導(dǎo)事件中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。MAPK信號(hào)通路中ERK，JNK，p38 MAPK 3類(lèi)活化形式在RA患者滑膜組織中顯示出不同的定位模式。磷酸化的p38MAPK在滑膜微血管的內(nèi)皮和滑膜襯里層的細(xì)胞中均表達(dá)。相比之下，在滑膜微血管周?chē)ひr里區(qū)域內(nèi)的單核浸潤(rùn)細(xì)胞中檢測(cè)到ERK MAPK的激活，而JNK MAPK主要在下襯區(qū)域的單核浸潤(rùn)細(xì)胞中顯示出活性[22]。TNF-α，IL-1，IL-6 通過(guò)誘導(dǎo)滑膜中存在的許多細(xì)胞產(chǎn)生 IL-8，MMP和黏附分子，在促進(jìn) RA發(fā)生中起重要作用，從而進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥和軟骨破壞。此外，TNF-α和IL-1在炎癥滑膜組織p38和ERK MAPK的活化中發(fā)揮重要的體內(nèi)作用，因TNF-α或 IL-1阻斷降低了TNF-α滑膜中這些MAPK的活化[25]。

綜上所述，蠲痹湯中的黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、揮發(fā)油、香豆素類(lèi)等通過(guò)抑制炎癥及自身免疫疾病相關(guān)的TNF，IL-6，IL-17，Th17，PTGS2，JUN 等眾多靶點(diǎn)，進(jìn)而抑制AGE-RAGE，IL-17，TNF，Th17 細(xì)胞分化、MAPK 等與炎性反應(yīng)、自身免疫相關(guān)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療作用。目前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究雖在中藥復(fù)方作用機(jī)制方面取得了不俗成就，但也存在一些問(wèn)題需要克服，如復(fù)方中藥劑量與藥理作用之間的關(guān)系，提取濃縮過(guò)程中藥物成分變化，藥物成分之間的相互作用對(duì)藥效的影響都是需要解決的問(wèn)題，還有待進(jìn)一步深入研究。