陳曦 劉忠泉 王彬 朱慧 付雷 李媛媛 陸宇

結核分枝桿菌是一種細胞內寄生菌，可在巨噬細胞內存活并繁殖，憑借在巨噬細胞內生長的特性逃逸機體免疫防御作用。治療結核分枝桿菌感染的關鍵是選用具有良好抗菌活性并且能在巨噬細胞內達到有效抑菌濃度的藥物。因此，在評估一種藥物對結核分枝桿菌是否有效時，不僅要評估其細胞外抗菌活性，也要評估其細胞內抗菌活性。為提高耐藥結核病治療的有效性，圍繞新的藥物靶點開發(fā)新型抗結核藥物已成為當務之急。體外藥效學評價是抗結核新藥研發(fā)的第一步，也是關鍵步驟；其中抗結核藥物細胞內抗菌活性是進行體外藥效學評價的重要指標之一。本研究針對目前開發(fā)的新型抗結核藥物，以及臨床上應用的抗結核藥物進行了巨噬細胞內抗菌活性比較，并且對抗結核藥物的胞內濃度進行了分析，評價體外巨噬細胞內抗結核活性測定對新藥篩選的作用。

材料和方法

一、儀器與材料

1. 儀器：高效液相色譜-質譜工作站(UPLC-MS/MS分析系統(tǒng)，由Agilent1290高效液相色譜儀和Agilent6460質譜檢測器組成，安捷倫科技有限公司，美國)、Thermo Fisher低溫離心機(賽默飛世爾科技有限公司，美國)、METTLER-TOLEDO電子分析天平(梅特勒-托利多集團公司，瑞士)、Milipore 超純水機(默克密理博科技有限公司，美國)、二級生物安全柜(藝思高科技有限公司，新加坡)、二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司，美國)、Tecan Infinite 200酶標儀(帝肯集團公司，瑞士)。

2. 試劑與材料：0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)基(Gibco生命科技有限公司，美國)、Middlebrook 7H9 (BD 生物科技有限公司，美國)、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水、0.1% SDS裂解液、Middlebrook 7H10 (BD 生物科技有限公司，美國)、OADC增菌液(BD 生物科技有限公司，美國)、色譜純甲醇、色譜純乙腈、超純水。

3. 實驗藥物：利福平(RFP，Sigma，BCBP4553V)、異煙肼(INH，Sigma，MKBV9495V)、左氧氟沙星(Lfx，Sigma，BCBF7004V)、吡嗪酰胺(PZA，Sigma，031M1778V)、貝達喹啉(TMC207，上海瀚香生物科技有限公司，843663-66-1)、硝基咪唑類藥物PA-824(Sigma，187235-37-6)、利奈唑胺(LZD，中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、氯苯吩嗪(CFZ，上海瀚香生物科技有限公司，2030-63-9)、苯并噻嗪酮類藥物PBTZ-169和BTZ-043(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、利奈唑胺同類藥物OTB-658(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、氯苯吩嗪衍生物TBI-166(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、TZY-5-84(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所)、NTB-3119H(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)。

4. 細胞與菌株：J774.1 巨噬細胞(購自北京協(xié)和細胞資源中心)、結核分枝桿菌H37Rv標準株(ATCC 27294，北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室凍存)。

二、 實驗方法

本研究于2018年9月至2019年3月測定了14種抗結核藥物的最低抑菌濃度和巨噬細胞內抗結核活性；并測定了其中8種抗結核藥物在巨噬細胞內的藥物濃度。

(一)最低抑菌濃度測定

采用微孔培養(yǎng)顯色法(MABA法)測定90%最低抑菌濃度(MIC90)。

(1) 結核分枝桿菌單菌落懸液制備：結核分枝桿菌H37Rv接種于含10% OADC、0.05%吐溫-80的7H9液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3周至對數生長期，8 μm濾膜過濾細菌懸液，獲得單菌懸液，菌液經10倍稀釋后接種于7H10固體培養(yǎng)基，4周后進行菌落計數，確定單菌懸液的濃度(CFU/ml)(CFU：菌落形成單位)。(2)藥物的制備及菌液接種：取無菌96孔培養(yǎng)板，第1排前6孔加入200 μl 7H9培養(yǎng)基，設為陰性對照孔，后6孔加入100 μl 7H9培養(yǎng)基和等體積的單菌落懸液，設為陽性對照孔；除第1排外，其余各排第1列分別加入含有實驗藥物(RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H)的7H9培養(yǎng)基200 μl，剩余各孔分別加入100 μl 7H9培養(yǎng)基，從第1列吸取100 μl含藥培養(yǎng)基加入第2列，依次連續(xù)倍比稀釋至最后一列。然后在除陰性對照孔之外的各孔中加入制備好的單菌落懸液100 μl，使每孔中最終培養(yǎng)容積均為200 μl，菌液終濃度為4×105CFU/ml。(3)孵育條件：37 ℃培養(yǎng)7 d。(4) 加入顯色試劑：在已培養(yǎng)7 d的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入Alamar Blue 20 μl，20% 吐溫-80 12.5 μl，混合均勻(避光操作)。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。(5)結果判讀：應用酶標儀測定吸光度值，并計算MIC90。

(二)巨噬細胞內抗結核藥物活性測定

(1)J774.1單核巨噬細胞的制備：在75 cm2細胞培養(yǎng)皿中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至占培養(yǎng)皿面積的80% 時，以0.25% 胰蛋白酶2 ml室溫消化1 min，棄去胰酶后加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打貼壁巨噬細胞，制成細胞懸液；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調整細胞濃度至4×105個/ml，在24孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入1 ml細胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育16 h，貼壁細胞用于結核分枝桿菌的感染。(2)結核分枝桿菌感染巨噬細胞：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將結核分枝桿菌凍存菌液稀釋為2×106CFU/ml的細菌懸液。向孵育貼壁巨噬細胞的24孔細胞培養(yǎng)板中加入1 ml/孔的細菌懸液，即感染復數為5∶1；37 ℃孵育3 h，吸棄含菌培養(yǎng)基，用無菌1×PBS洗滌2次，以除去胞外結核分枝桿菌。(3)實驗藥物的制備及處理細胞：精密稱取14種抗結核藥物RFP、INH、Lfx、PZA、TMC207、CFZ、LZD、PA-824、TBI-166、OTB-658、PBTZ-169、BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H，用二甲基亞砜(DMSO)或超純水溶解并定容為1 mg/ml。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋待測藥物，終濃度設為5、2和0.50 μg/ml。向含有已感染結核分枝桿菌的貼壁巨噬細胞的24孔培養(yǎng)板中加入新鮮配制的含有不同濃度實驗藥物的培養(yǎng)基，2 ml/孔，37 ℃孵育72 h。并設不經藥物處理的陰性對照孔，所有試驗孔均設復孔。(4)巨噬細胞的裂解及細胞內結核分枝桿菌計數：藥物處理貼壁巨噬細胞72 h后，吸棄含藥培養(yǎng)基，向24孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入200 μl 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，37 ℃ 靜置5 min以裂解細胞，隨后各孔中加入800 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，中和裂解，裂解液混勻后用生理鹽水進行10倍系列稀釋。分別取100 μl不同濃度的稀釋液接種到7H10固體培養(yǎng)板上，37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)3～4周，進行菌落計數。

(三)巨噬細胞內抗結核藥物濃度測定

(1)J774.1單核巨噬細胞的制備：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調整巨噬細胞濃度至1×106個/ml，在直徑9 cm細胞培養(yǎng)皿中加入10 ml細胞懸液，使細胞數量為1×107個/培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育16 h，吸棄培養(yǎng)基，貼壁細胞用于藥物處理及檢測實驗藥物的細胞內濃度。(2)藥物的制備與處理巨噬細胞：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋待測的8種抗結核藥物RFP、INH、Lfx、TMC207、CFZ、LZD、TBI-166、PBTZ-169，終濃度分別為20、10和5 μg/ml。向孵育貼壁細胞的培養(yǎng)皿中加入10 ml各濃度的含藥培養(yǎng)基，藥物處理細胞3 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，加入1×PBS洗滌1次，以去除細胞外藥物。所有試驗均設不經藥物處理的陰性對照，脂溶性藥物RFP、TMC207、CFZ和抗結核新化合物TBI-166、PBTZ-169測定試驗中設置藥物處理的0 h對照。(3)收集細胞及待測樣品：向藥物處理后的細胞培養(yǎng)皿中加入2 ml的0.25% 胰蛋白酶，消化20 s；隨后加入3 ml 新鮮培養(yǎng)基中和胰酶，吹打貼壁細胞使其懸浮，收集細胞懸液，4 ℃ 100×g離心5 min，棄去培養(yǎng)基，每份細胞樣品加入1 ml去離子水，重懸細胞后4 ℃放置1 h，經鏡下觀察確認細胞完全裂解。細胞裂解液4 ℃ 2000×g離心10 min，留取沉淀加入1 ml去離子水混勻，同時留取上清液。不經含藥培養(yǎng)基孵育的細胞陰性對照樣品收集方法同上。(4)高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)法測定藥物濃度：巨噬細胞內藥物濃度測定方法見文獻[1-2]。取未經藥物處理的空白細胞裂解液分別稀釋實驗藥物標準品，分別制備標準曲線。各取上一步中收集的離心沉淀懸液和上清液樣品200 μl加入等體積的乙腈，充分混勻， 4 ℃ 13 800×g離心10 min，收集上清進行質譜分析。色譜條件：根據實驗藥物選擇甲醇-甲酸銨水溶液(含5 mmol/L 甲醇和0.1%甲酸；85∶15, v/v)或乙腈-甲酸銨水溶液(含5 mmol/L 乙腈和0.1%甲酸；8∶92,v/v)為流動相，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱[2.1 mm×100 mm,3.5 μm(柱子直徑2.1 mm，長度100 mm，柱子中硅膠填料粒徑3.5 μm)]，流率為0.2 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μl；質譜條件：質譜采用電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為正離子模式，選擇多反應離子監(jiān)測(MRM)方式掃描。

三、統(tǒng)計學處理

CFU計數轉換為lg(CFU/ml)，應用SPSS 23.0軟件進行區(qū)組資料的多因素方差分析，比較各藥物處理組與未經藥物處理組間巨噬細胞內結核分枝桿菌的lg(CFU/ml)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MIC90測定

藥物的胞外MIC90見表1。結果顯示，胞外抗結核活性最強的藥物為苯并噻嗪類的PBTZ-169和BTZ-043，其MIC90分別低至0.0005 μg/ml和0.002 μg/ml。抗結核活性最弱的為PZA，其MIC90高達200 μg/ml。

二、 巨噬細胞內藥物的抗結核活性檢測

受試藥物在巨噬細胞內的抗結核活性數據見表1。 RFP、INH、Lfx、TMC207、PA-824、CFZ、TBI-166、NTB-3119H、LZD、TZY-5-84、PBTZ-169和BTZ-043呈明顯的劑量-效應關系。細胞培養(yǎng)基中藥物濃度為0.50 μg/ml時，INH、PBTZ-169、TMC207、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84、PA-824分別降低巨噬細胞內結核分枝桿菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01 和1.00 lg(CFU/ml)；細胞培養(yǎng)基中藥物濃度為2 μg/ml時，INH、PBTZ-169、TMC207、CFZ、NTB-3119H、BTZ-043、TZY-5-84、Lfx、PA-824分別降低巨噬細胞內結核分枝桿菌2.18、1.91、1.65、1.55、1.47、1.44、1.29、1.24和1.15 lg(CFU/ml)；細胞培養(yǎng)基中藥物濃度為5 μg/ml時，PBTZ-169、NTB-3119H、INH、CFZ、TMC207、PA-824、TZY-5-84、BTZ-043、RFP、Lfx和TBI-166分別降低巨噬細胞內結核分枝桿菌4.78、2.48、2.33、2.09、1.91、1.48、1.48、1.46、1.44、1.37 和1.34 lg(CFU/ml)。胞內活性最強的為INH、PBTZ-169和TMC207，其中PBTZ-169在5 μg/ml時，顯示出了完全的殺菌活性；與其他抗結核藥物相比，同屬一類的LZD和OTB-658的胞內抗結核活性弱，PZA的胞內抗結核活性微弱。

表1 細胞培養(yǎng)基中各種藥物在不同濃度時巨噬細胞內單菌懸液的濃度和體外MIC90值

注5 μg/ml、2 μg/ml、0.5 μg/ml、0 μg/ml為培養(yǎng)孔內細胞培養(yǎng)基中的藥物濃度；陰性對照為培養(yǎng)孔內的巨噬細胞在不含藥物的同等容積細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；“-”：無值。lg(CFU/ml)降低值=陰性對照單菌懸液的lg(CFU/ml)均值(4.78)—培養(yǎng)基中不同藥物濃度時巨噬細胞內單菌懸液的lg(CFU/ml)均值

三、抗結核藥物在巨噬細胞內濃度分析

藥物在巨噬細胞內的濃度見表2。為排除脂溶性藥物RFP、TMC207、CFZ和抗結核新化合物TBI-166、PBTZ-169 與細胞壁結合對巨噬細胞內藥物濃度測定的影響，筆者測定了這些藥物和化合物處理細胞0 h時細胞裂解液中的藥物濃度，并以此為基線。在培養(yǎng)基中藥物濃度為5 μg/ml時，PBTZ-169、TMC207、RFP、CFZ、TBI-166和Lfx在巨噬細胞內的濃度為0.60、0.80、0.48、0.78、0.17和0.37 μg/ml，分別為其MIC90值的1200.00、26.67、9.60、6.50、4.25和1.48倍，且隨著培養(yǎng)基內藥物濃度的升高二者比值也相應升高。雖然只在培養(yǎng)基含藥濃度為20 μg/ml時測出INH的胞內濃度，但其與MIC90的比值也高達5.40倍；與上述幾種藥物相比，LZD 的巨噬細胞內濃度與MIC的比值只在培養(yǎng)基中藥物濃度提高至20 μg/ml時才升高到1.28倍，這些結果提示不同的抗結核藥物進入巨噬細胞的能力存在較大差異，也表明其進入巨噬細胞的能力即細胞內藥物濃度以及與MIC的關系是細胞內活性的決定因素。

討 論

巨噬細胞對于結核分枝桿菌來說，不僅是逃逸宿主免疫效應的避風港，而且也是逃避藥物殺傷的屏障。藥物若要對巨噬細胞內吞噬的結核分枝桿菌發(fā)揮作用，必需經過進入巨噬細胞、溶酶體及結核分枝桿菌細胞膜的過程，因此藥物進入巨噬細胞是發(fā)揮細胞內抗結核活性所必需的。此外，還與各種藥物對結核分枝桿菌的最低抑菌濃度相關。本研究評價不同作用靶點的14種抗結核藥物在巨噬細胞內、外的抗結核活性，以說明巨噬細胞內抗結核活性的作用及相關性。

表2 8種抗結核藥物在巨噬細胞內的濃度

注“-”：未測出或未檢測；3 h-0 h：3 h與0 h的胞內藥物濃度差值；胞內藥物濃度/MIC90值：帶a角標的數值與MIC90值的比值

本研究中MABA法測得的MIC90結果與文獻報道一致[3-4]。筆者發(fā)現LZD和OTB-658的細胞外抗菌活性(MIC90)與細胞內抗菌活性并不完全一致，其MIC90均較低，但并未表現出良好的胞內抗菌活性。其中LZD已應用于臨床治療，其在臨床化療中的優(yōu)勢與其對細菌的滅菌活性相關。上述兩種藥物的體外MIC90結果和細胞內活性的非對應關系，提示了藥物的體外MIC90結果的局限性，也顯示細胞內活性測定的重要作用；但二者均為體外活性的評價方法，藥物活性評價必須要進行感染動物實驗的藥效評價，以更準確地評價新藥的抗結核活性。但對于PBTZ-169、BTZ-043、TMC207、PA-824來說，其胞內、外抗菌活性均表現優(yōu)異，抗結核活性最佳的PBTZ-169與BTZ-043，二者同屬于苯并噻嗪類藥物，BTZ-043的72 h內殺菌活性與INH相似，細菌代謝的最早階段即可被其阻止[5]；PBTZ-169的活性更優(yōu)于BTZ-043，在5 μg/ml時，表現出完全的胞內殺菌活性，這與文獻報道結果一致[6-7]。分析其原因：(1)PBTZ-169與BTZ-043具有良好的體外抗結核活性，MIC90值低；(2)PBTZ-169與BTZ-043均具有進入巨噬細胞的能力并達到了MIC90值以上。吡嗪酰胺在人體中胞內殺菌效果較好，但本研究發(fā)現PZA在體外的細胞內抗結核活性比較差，這與Heifets等[8]的研究結果類似；因PZA需要在酸性環(huán)境下才能發(fā)揮抗結核活性，因此推測在本研究模型中PZA進入巨噬細胞后尚未被吞噬溶酶體攝取，胞質中pH條件不是PZA發(fā)揮殺菌活性的最佳條件。

抗結核藥物細胞內藥效評價涉及因素較多。鄭海琴等[9]之前的研究顯示，感染復數、感染時間和藥物作用時間均對胞內抗結核活性有影響；另外，還發(fā)現感染菌的活力也會對結果產生影響，因此本研究對上述影響因素進行了進一步的優(yōu)化。用于結核分枝桿菌感染的巨噬細胞系常選用RAW264.7和J774.1兩種，相比RAW264.7細胞，雖然J774.1細胞傳代后貼壁時間稍長，但是細胞生長狀態(tài)更易保持穩(wěn)定且不易向終末細胞分化，因此本研究中選用J774.1細胞系作為感染模型。

抗結核藥物在巨噬細胞模型中的細胞內濃度是評價其活性的重要內容之一。目前，測定細胞內藥物濃度的方法主要有高效液相色譜法和液質聯(lián)用法。本研究采用HPLC-MS-MS方法直接測定細胞內藥物濃度。 Baietto等[10]用超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS-MS)方法測定了EMB、INH、RFP與PZA在患者外周血單核細胞(PBMC)內的濃度，與本研究相比，這些藥物進入PBMC和巨噬細胞內的能力并不相同。

本研究表明，與體外MIC90測定相比較，藥物在巨噬細胞內的濃度可以體現出藥物進入巨噬細胞的能力，是胞內發(fā)揮抗結核活性的重要因素，也是發(fā)現新藥不同體外活性的一個重要評價內容。在臨床治療藥物選擇組成方案時，要充分考慮各種藥物的抗菌活性與特性，結核分枝桿菌是胞內致病菌，選擇能在巨噬細胞內達到有效抑菌濃度的抗菌藥物，即選擇那些能夠有效滲透進入細胞的抗結核藥物非常重要。

本研究的局限之處是沒有采用多種細胞模型，以及沒有納入更多的抗結核藥物。在后續(xù)的研究中，隨著更多藥物的納入，以及針對各種藥物在巨噬細胞內PK/PD 的研究及細胞器分布，必將豐富及完善巨噬細胞內抗結核藥物活性研究的理論，并為開展后續(xù)的體內實驗及臨床應用提供幫助。