楊翰 李歡 郗雋 李愛芳 徐紀(jì)茹

共生微生物體積小，但數(shù)量及種類多，體細(xì)胞和共生微生物分布在人體皮膚、呼吸道、口腔和胃腸道、尿道等部位，形成一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)[1]，其動態(tài)平衡與人體健康高度相關(guān)。其中腸道菌群在多個方面都對人體的健康起到重要作用，如降低膽固醇和血脂[2]、合成代謝維生素[3-4]，以及對人體的免疫力也有著重要作用[5-6]。已有研究證明，腸道菌群與全身多種疾病(糖尿病、關(guān)節(jié)炎、哮喘等)都存在著直接聯(lián)系[7-9]；腸道菌群與癌癥的免疫療法提示其在疾病的治療方面也有著良好的前景[10-12]；而結(jié)核病患者與腸道菌群的多樣性也有著密切的關(guān)系[13-15]。本研究旨在分析正常人群與初治結(jié)核病患者腸道菌群的差異，對未來腸道菌群是否可以作為生物學(xué)標(biāo)記，以及特殊的腸道菌群結(jié)構(gòu)與結(jié)核病的易感性是否存在關(guān)聯(lián)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

資料和方法

一、資料收集

1. 研究對象：于2017年8月至2018年7月每月固定時間在西電集團(tuán)醫(yī)院收集當(dāng)天符合入組標(biāo)準(zhǔn)的健康體檢成年人糞便標(biāo)本2～3份，糞便標(biāo)本進(jìn)行-80 ℃低溫保存，收集30份標(biāo)本后停止納入，作為對照組；收集2017年8月至2018年7月西安市胸科醫(yī)院初步診斷為初治結(jié)核病患者的資料，同時對其糞便標(biāo)本進(jìn)行-80 ℃低溫保存，待患者診斷明確后將糞便標(biāo)本納入研究(結(jié)核病患者診斷明確前收集糞便標(biāo)本，有助于減少患者因用藥帶來的腸道菌群變化)，收集30份結(jié)核病患者糞便標(biāo)本后停止納入，作為結(jié)核組。

2. 兩組人群入組標(biāo)準(zhǔn)：對照組入組標(biāo)準(zhǔn)，年齡0～70歲，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)介于18.50～23.99，無其他身體基礎(chǔ)性疾病(糖尿病、高血壓等)。結(jié)核病患者入組標(biāo)準(zhǔn)，年齡0～70歲，BMI指數(shù)介于18.50～23.99，無其他身體基礎(chǔ)性疾病(糖尿病、高血壓等)，未使用抗生素進(jìn)行治療。結(jié)核病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[16]，診斷為初治活動性肺結(jié)核。

3. 一般資料：對照組中，女17名，男13名；年齡24～47歲，平均(33.00±8.22)歲。結(jié)核組中，男16例，女14例；年齡22～49歲，平均(33.00±8.63)歲。兩組性別(χ2=0.07，P=0.795)和年齡(t=1.55，P=0.121)的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

C1000 Touch PCR儀、DCode變性凝膠電泳儀、Gel DOCTM 2000凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；InGenius3凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)；BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。糞便提取試劑盒Stool DNA Kit(貨號：D4015-01；美國Omega Bio-Tek公司)；丙烯酰胺、N, N′-亞甲基雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺(美國Promega公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)；溴化乙錠(德國Sigma公司)；DL2000 DNA Maker、Premix Taq(日本TaKaRa公司)。

(二)試驗方法

1. 糞便DNA提?。?1)將糞便內(nèi)菌群與雜質(zhì)分離，在2 ml離心管中加入最多200 mg糞便樣品，并將離心管放在冰上。加入1.6 ml SLX-Mlus 緩沖液渦旋振蕩直到糞便樣品徹底均勻化；加入180 μl DS 緩沖液，顛倒混勻5次；全速離心(13 000×g) 3 min；取1.5 ml上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管內(nèi)。(2)將分離的菌群破壁并釋放核酸，加入600 μl SP2 緩沖液，渦旋振蕩10 s；于冰上放置5 min；全速離心(13 000×g) 3 min；取600 μl上清加入至新的2 ml離心管內(nèi)；加入200 μl cHTR 溶液渦旋振蕩10 s，室溫放置2 min；全速離心(13 000×g)2 min；取600 μl上清至新的2 ml離心管內(nèi)；加入20 μl蛋白酶K混勻；加入600 μl BL緩沖液，渦旋振蕩10 s；70 ℃溫育10 min，期間渦旋混勻2次；瞬時離心。(3)利用吸附柱純化菌群核酸，取試劑盒自帶吸附柱(型號：HiBind DNA Mini Column)插入新的2 ml 廢液管；吸取6步所得液體600 μl(包含所有沉淀物質(zhì))至吸附柱內(nèi)，全速離心(13 000×g)1 min，棄廢液管內(nèi)液體；重復(fù)7步2次，直到所有樣本用完，使樣本核酸固定在吸附柱上；將離心柱插入新的2 ml廢液管，加入500 μl VHB緩沖液，全速離心(13 000×g)30 s，棄廢液管內(nèi)液體；加入700 μl DNA Wash 緩沖液，全速離心(13 000×g)30 s，棄廢液管內(nèi)液體重復(fù)10步，清洗掉除核酸外的其余雜質(zhì)；將11步所得HiBind DNA Mini Column吸附柱空離2 min，并開蓋室溫放置2 min，保證無水乙醇全部揮發(fā)，以免影響核酸質(zhì)量；將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管內(nèi)，加入200 μl 60 ℃預(yù)熱好的Elution 緩沖液，室溫放置2 min，全速離心(13 000×g)1 min，洗脫吸附柱上的核酸；上述收集的核酸保存于-20 ℃。

2. DNA擴(kuò)增：選擇細(xì)菌的16S rRNA-V3區(qū)的通用引物擴(kuò)增V3區(qū)基因，通用引物為含有GC夾(含GC夾引物在DGGE電泳時防止雙鏈完全解開)(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC-GGGGGCACGGGGGG-3′)的341F(5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG-3′)和534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTG)。擴(kuò)增體系為Premix Taq 25 μl，引物341F-GC/534R(10 μmol/L)各1 μl，H2O 19 μl，DNA模板4 μl。PCR反應(yīng)程序預(yù)變性 94 ℃ 5 min，94 ℃變性 30 s，退火溫度初次設(shè)定為 56.5 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，33個循環(huán)。72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖電泳驗證是否有目標(biāo)大小基因片段。

3. 變性梯度凝膠電泳[17](denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)指紋圖譜分析：30%～65%線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠配置，30%變性劑(100 ml)由40%雙丙烯酰胺20 ml、50×TAE核酸電泳緩沖液2 ml、甲酰胺12 ml、尿素12.6 g，超純水定容至100 ml，65%變性劑(100 ml)由40%雙丙烯酰胺20 ml、50×TAE核酸電泳緩沖液2 ml、甲酰胺26 ml、尿素27.3 g，超純水定容至100 ml。兩種變性劑各加入10%過硫酸銨 200 μl、TEMED 40 μl，利用制膠器迅速灌入提前制好的垂直膠板中。將膠裝置在電泳系統(tǒng)中，在新配置的1×TAE 電泳緩沖液中，以 150 V電壓預(yù)電泳30 min，然后取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與6×loading buffer 緩沖液混勻，加入到上樣孔中，安裝好電泳系統(tǒng)后，開始電泳：先以 60 V電壓電泳1 h，后以 90 V電壓電泳14 h，電泳溫度設(shè)置為 60 ℃。電泳完畢后通過溴化乙錠溶液(0.5 g/ml)染色20 min，后用Gel DOCTM 2000凝膠成像儀凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像標(biāo)記。

4. 條帶回收及測序：在紫外燈下，使用干凈刀片仔細(xì)切下所選的主要條帶。將凝膠使用Elution緩沖液沖洗2次后，將凝膠在20 μl Elution緩沖液中研磨碎4 ℃過夜后作為模板。改用V3區(qū)通用引物(不含GC夾)，反應(yīng)體系及程序同第二步。使用瓊脂糖電泳檢測到目的條帶后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對。

5. 腸道菌群多樣性(細(xì)菌物種總數(shù)及豐富度)分析：使用Quantity One?1-D軟件分析指紋圖譜中的各樣本條帶數(shù)(每個條帶代表一種細(xì)菌種類)和灰度值(代表該細(xì)菌核酸序列的數(shù)量)，獲得菌群的香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon Wiener index；簡稱“H′指數(shù)”)。香農(nóng)-威納指數(shù)包含物種種數(shù)及各組間個體分配的均勻性，可以通過一個具體的數(shù)值來簡單地反映菌群多樣性的大小。公式如下[18]：

其中S為種數(shù)，Pi為樣品中屬于第i種個體的比例。同時對菌群進(jìn)行非加權(quán)聚類分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)。制作Dice相似性系數(shù)(Dice coefficient of similarity，簡稱“Cs”)累積曲線，橫坐標(biāo)為Cs值，縱坐標(biāo)為小于特定Cs值的比率，曲線越靠近橫坐標(biāo)，表明組內(nèi)菌群相似度越高。Cs值為兩組樣本間的相似度，在使用Quantity One?1-D軟件分析樣本時，各組樣本中選擇其中一例含有條帶數(shù)最全的樣本，以此為標(biāo)準(zhǔn)泳道，其他各樣本泳道與該樣本進(jìn)行對比(包含條帶位置與灰度值)，獲得具體的Cs值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

圖1 對照組1～15號患者的DGGE指紋圖譜 圖2 對照組16～30號患者的DGGE指紋圖譜 圖3 結(jié)核組1～15例患者的DGGE指紋圖譜 圖4 結(jié)核組16～30例患者的DGGE指紋圖譜

結(jié) 果

一、DGGE指紋圖譜分析

如圖1～4所示(Marker為DL2000 DNA Marker)，整體觀察其條帶數(shù)、明亮度及位置，在不同樣本中的差異代表著細(xì)菌種類的不同。對照組條帶數(shù)為(13.57±3.37)條，H′指數(shù)為2.55±0.27，均明顯高于結(jié)核組[條帶數(shù)為(8.60±4.19)條，H′指數(shù)為1.99±0.52]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.55，P<0.001；t=6.75，P<0.001)。對照組Cs值的M(Q1,Q3)為[22.90%(16.20%，29.30%)]，結(jié)核組Cs值的M(Q1,Q3)為[35.35%(23.73%，44.98%)]，兩組通過Wilcoxon秩和檢驗比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-73.38，P<0.001)。

注：右側(cè)數(shù)字代表人群編號，對照組為1～30號，結(jié)核組為31～60號；橫坐標(biāo)代表距離系數(shù)圖5 DGGE指紋圖譜的聚類分析(基于Cs值的UPGMA分析)

二、UPGMA聚類分析結(jié)果

如圖5所示，UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，對照組較好地聚集在了下支，說明該組內(nèi)的菌種豐富度的分布較為相似，而結(jié)核組內(nèi)各標(biāo)本進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，聚集分散。

三、Cs值累積分布曲線分析

Cs值累積分布曲線分析見圖6。對照組的組內(nèi)相似度較結(jié)核組低(曲線越靠近橫坐標(biāo)軸，表明組內(nèi)菌群相似度越高)。

圖6 兩組Cs值累積分布曲線

四、DGGE條帶切膠測序及序列比對結(jié)果

條帶測序結(jié)果顯示，對照組與結(jié)核組的主要腸道菌群以Bacteroides屬為主，Bacteroides屬在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但從表1中也可看出，部分種間存在差異。但結(jié)核組中Prevotella屬的構(gòu)成比低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)核組Unculturedbacterium屬的構(gòu)成比高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組腸道Prevotella/Bacteroides屬的比值(32.96%，59/179)高于結(jié)核組(11.39%，18/158)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.15，P<0.001)。

討 論

人體共生菌與機體的相互作用形成了一種穩(wěn)定的微生態(tài)，這種微生態(tài)有利于人類健康。結(jié)核分枝桿菌的感染與腸道菌群的變化，兩者的相互作用對機體健康有著一定的影響[19]。本研究的結(jié)果可以看出結(jié)核分枝桿菌對機體的感染、引起的免疫作用、對腸道菌群的改變有著直接的影響。

在DGGE的圖譜分析中可以看出健康人群的菌群豐富度、多樣性要高于結(jié)核組；在UPGMA聚類分析中，對照組聚類情況較好，結(jié)核組未能完全聚集在一起，也提示了對照組豐富度的相似性高，這與相關(guān)的報道也是吻合的[20]。結(jié)核病患者的機體免疫狀態(tài)對腸道菌群起到了一定的選擇作用，所以結(jié)核組相對于對照組內(nèi)的相似性更高。后期測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組主要菌群還是以Bacteroides屬為主，但是結(jié)核組內(nèi)出現(xiàn)的Unculturedbacterium屬克隆比例明顯升高，以及Prevotella菌屬比例下降，這可能是機體免疫選擇的一種結(jié)果，還需要進(jìn)一步研究。

筆者在對菌群成分分析時發(fā)現(xiàn)，腸道Prevotella/Bacteroides屬的比值在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對照組(32.96%)明顯高于結(jié)核組(11.39%)。Sandberg等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，Prevotella/Bacteroides屬比值越高，越有利于腸道代謝。Kovatcheva-Datchary 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，腸道Prevotella屬誘導(dǎo)在葡萄糖代謝改善中發(fā)揮作用，可能通過促進(jìn)糖原儲存增加。那么結(jié)核病患者腸道菌群中Prevotella屬的下降是否會影響腸道的代謝，導(dǎo)致結(jié)核病患者消耗體質(zhì)的發(fā)生，從上述的研究中似乎可以找到相應(yīng)的證據(jù)，這也是下一步研究的方向。

通過上述分析，筆者發(fā)現(xiàn)機體在結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病的最初狀態(tài)下，腸道菌群就發(fā)生了改變，結(jié)核分枝桿菌的感染對腸道內(nèi)菌群有一定的選擇性，因此組內(nèi)相似性就越高。這表明結(jié)核病發(fā)病會對腸道微生態(tài)帶來選擇性的改變，影響著腸道功能，如吸收、代謝等功能。

本研究的DGGE分析也存在一定的局限性，腸道菌群種類較多，但指紋圖譜中僅能反映主要的菌群，并不能完全反映出所有的信息。此外DGGE條帶分析時，菌群含量差異造成條帶亮度不同，在分析時會造成部分較暗條帶丟失，導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群信息獲得不全，而高通量測序技術(shù)在菌群的研究中可以更全面地獲得信息。DGGE較宏基因組學(xué)分析方法雖然存在諸多缺陷，但因其試驗成本低廉，結(jié)果直觀，結(jié)果分析對生物信息學(xué)要求不高，目前仍然在該類研究中使用，適合研究人員對菌群的初步研究。

表1 腸道菌群在兩組人群間的分布情況

綜上所述，雖然DGGE技術(shù)存在一定的局限性，但能夠客觀地反映腸道菌群主要的差異，健康人群與初治結(jié)核病患者腸道菌群因為機體免疫狀況的不同而存在差異，腸道菌群的恢復(fù)是否能改善結(jié)核病患者消耗性體質(zhì)及預(yù)后也是未來的研究方向[23]。本研究僅對結(jié)核病患者在最初感染時的腸道菌群變化進(jìn)行了對比。在結(jié)核病常規(guī)治療中使用的抗生素會導(dǎo)致明顯且持久的微生態(tài)失調(diào)，也是值得關(guān)注的問題[24]。