吳躍章 Zeinab Abdelrahaman 千文 池田勝也 楊長青

[摘要]目的 通過優(yōu)化玻璃珠破碎法的條件，制備最具活性的重組人CYP2C9酵母微粒體，從而為建立更加靈敏快捷的體外代謝篩選模型提供依據(jù)。方法 利用玻璃珠破碎的方法，制備重組人CYP2C9酵母微粒體。通過改變渦旋振蕩次數(shù)和玻璃珠用量，優(yōu)化制備微粒體的條件。用Lowry法測定微粒體中的蛋白含量，用CYP2C9的典型底物雙氯芬酸與微粒體進(jìn)行反應(yīng)，以單位時間（h）內(nèi)單位蛋白（mg/ml）所對應(yīng)的雙氯芬酸代謝物4-羥基雙氯芬酸的生成量來確定微粒體的蛋白活性。結(jié)果 隨著渦旋振蕩次數(shù)和玻璃珠用量的增加，所制備微粒體蛋白的含量增加。當(dāng)渦旋振蕩次數(shù)為30次（每次渦旋振蕩30 s，冷卻60 s），玻璃珠用量為0.75 g時，代謝物生成量和單位時間單位蛋白所對應(yīng)代謝物生成量最大，分別為1.21 μg和0.06 μg/[（mg/ml）·h]。結(jié)論 玻璃珠破碎法制備重組人CYP2C9酵母微粒體的最佳條件為渦旋振蕩30次（每次渦旋振蕩30 s，冷卻60 s）和0.75 g玻璃珠。

[關(guān)鍵詞]重組人CYP2C9酵母;微粒體;玻璃珠;雙氯芬酸

[中圖分類號] R969.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（c）-0008-06

[Abstract] Objective To prepare the most active recombinant human CYP2C9 yeast microsomes by optimizing the conditions of glass bead crushing method， thus provide and establish more sensitive and rapid in vitro metabolic screening model with the minimum metabolic content degradation. Methods Recombinant CYP2C9 human microsomes content was prepared by glass bead crushing method. By changing the number of vortex oscillations and the amount of glass beads， the conditions of preparing microspheres were optimized. Lowry method was used to determine protein and metabolite concentration in microsomes. The reaction with microsomes was carried out using Diclofenac， which was a typical substrate for 2C9 microsomes. The protein activity of microsomes was determined by the yield of diclofenac metabolite （4-hydroxy diclofenac） corresponding to unit protein （mg/ml） per unit time （h）. Results With the increase of the number of vortex oscillations and the amount of glass beads， the content of the prepared microsomal protein increased. When the number of vortices oscillated 30 times （30 s per vortex oscillation， 60 s of cooling） and the amount of glass beads was 0.75 g， the metabolite production and the corresponding metabolite production per unit of protein per unit of time were the largest， 1.21 μg and 0.06 μg/[（mg/ml）·h] respectively. Conclusion The optimal condition for preparation of recombinant human CYP2C9 yeast microsomes with minimum content degradation using glass beads lysis process was 30 cycle consist of （30 s per vortex oscillation， 60 s of cooling） and amount of 0.75 g glass beads.

[Key words] Recombinant human CYP2C9 yeast; Microsomes; Glass beads; Diclofenac

基因重組酵母是一種利用基因重組技術(shù)，將外源目的基因轉(zhuǎn)錄至酵母細(xì)胞中，使之表達(dá)相應(yīng)蛋白的酵母[1-3]。重組人代謝酶酵母能夠表達(dá)人肝微粒中不同亞型的CYP450酶[4]，與其他表達(dá)系統(tǒng)（如大腸埃希菌[4-5]、哺乳動物細(xì)胞[6]和昆蟲細(xì)胞[7]等）相比，具有重組酶表達(dá)量和催化活性相對較高、生產(chǎn)周期短以及適合于大批量制備藥物代謝物等[8]優(yōu)點(diǎn)，因而具有突出優(yōu)勢。Dragan等[9]通過重組人CYP2C9酵母全細(xì)胞反應(yīng)體系，制備了雙氯芬酸的代謝物，但是不同藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)各不相同，因此利用重組人CYP450酵母全細(xì)胞反應(yīng)體系進(jìn)行不同藥物代謝途徑及代謝物的篩選仍存在一定困難。

酵母是最簡單的真核生物之一，含有與哺乳動物細(xì)胞類似的細(xì)胞器[10-11]。通過組織勻漿和差速離心的方法[12]，可以制備動物肝微粒體，同樣，破碎酵母細(xì)胞也能夠制備酵母微粒體[13]。利用重組人CYP450酵母微粒體對藥物的代謝途徑及代謝物進(jìn)行篩選，可以消除酵母細(xì)胞本身（主要是細(xì)胞壁）[14-15]的干擾，使篩選結(jié)果更接近于人體。因此通過優(yōu)化破碎方法制備最具活性的酵母微粒體，對微粒體反應(yīng)體系靈敏度的提升具有重要意義。

本研究以重組人CYP2C9酵母為研究對象，以CYP2C9典型底物雙氯芬酸的代謝物的生成量及單位時間（h）內(nèi)單位蛋白（mg/ml）所生成的代謝物量為指標(biāo)，通過改變渦旋振蕩次數(shù)和玻璃珠用量，探討玻璃珠破碎法制備酵母微粒體的最優(yōu)條件，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

LC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司）;渦旋振蕩器XW-80A（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;玻璃珠（美國Biospec公司，直徑為0.5 mm）;48孔板（無錫耐思生物科技有限公司）。

1.1.2試劑

重組人CYP2C9酵母、未轉(zhuǎn)染酵母和4-羥基雙氯芬酸（純度≥98.0%）由南京珼瑞斯生物醫(yī)藥科技有限公司提供。還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生系統(tǒng)試劑購自匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司。Lowry蛋白濃度測定試劑盒、Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids和PMSF購自北京索萊寶科技有限公司。雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）和L-Histidine購自東京化成工業(yè)株式會社（TCI）。Leu Minus media購自北京泛基諾科技有限公司。Yeast Extract和Tryptone購自英國Oxoid公司。葡萄糖和DL-二硫蘇糖醇（DTT）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。三氟乙酸（分析純）和二水合EDTA二鈉購自南京化學(xué)試劑股份有限公司。蔗糖購自西隴科學(xué)股份有限公司。瓊脂粉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1玻璃珠預(yù)處理

玻璃珠用濃鹽酸浸泡24 h，濾去濃鹽酸，用去離子水洗滌至中性，在60℃烘箱中干燥16 h，于4℃保存。使用前，將預(yù)處理后的玻璃珠置于冰上備用。

1.2.2未轉(zhuǎn)染酵母菌和重組人CYP2C9酵母菌的培養(yǎng)

1.2.2.1 SD-His培養(yǎng)基（g/L）? Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 6.7，L-Histidine 0.02，葡萄糖20，瓊脂粉20（制備固體培養(yǎng)基時添加）。使用前，于115℃滅菌30 min，葡萄糖配制成20%溶液單獨(dú)滅菌。

1.2.2.2 YPD培養(yǎng)基（g/L）? Yeast Extract 10，Tryptone 20，葡萄糖20，瓊脂粉20（制備固體培養(yǎng)基時添加）。使用前，于115℃滅菌30 min，葡萄糖配制成20%溶液單獨(dú)滅菌。

1.2.2.3未轉(zhuǎn)染酵母菌培養(yǎng)流程? 將甘油中保存的未轉(zhuǎn)染酵母菌接種至YPD固體培養(yǎng)基上，放置生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d（30℃）。3 d后取16個單顆菌落（直徑≥2 mm），轉(zhuǎn)移至含有1400 ml YPD培養(yǎng)基的2 L三角培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3 d（30℃，200 r/min）。離心稱重，按照菌重與培養(yǎng)基體積比1∶1加入YPD培養(yǎng)基，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.4重組人CYP2C9酵母培養(yǎng)流程? 將甘油中保存的重組人CYP2C9酵母菌接種至SD-His固體培養(yǎng)基上，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d（30℃）。5 d后取16個單顆菌落（直徑≥2 mm），轉(zhuǎn)移到含有200 ml SD-His液體培養(yǎng)基的500 ml三角培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)40～48 h（30℃、200 r/min）。40～48 h后將培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移至2 L的三角培養(yǎng)瓶中，并加入1400 ml YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d（30℃、200 r/min）。離心稱重，按照菌重與培養(yǎng)基體積比1∶1加入SD-His培養(yǎng)基，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3未轉(zhuǎn)染酵母微粒體和重組人CYP2C9酵母微粒體的制備

1.2.3.1酵母微粒體緩沖液的制備? 10%蔗糖，0.1 mol/L pH 7.4磷酸鉀緩沖液，0.1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA（臨用前加入1 mmol/L PMSF）。

1.2.3.2未轉(zhuǎn)染酵母微粒體的制備? 取所培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染酵母菌菌液5 ml（約含酵母菌2.5 g），離心除去YPD培養(yǎng)基，按菌重與緩沖液體積比1∶1加入酵母微粒體緩沖液，渦旋使之充分混懸。將混懸液分裝入2 ml EP管中，使得每個EP管中含有1 ml混懸液（約含酵母菌0.5 g），并分別加入0.5 g玻璃珠，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30次（每次渦旋振蕩30 s，冰上冷卻60 s），離心（1000 g，10 min）取上清，再次離心（5000 g，1 h）取上清，上清即為未轉(zhuǎn)染酵母微粒體混懸液[16]。于-20℃保存。

1.2.3.3重組人CYP2C9酵母微粒體的制備? 取培養(yǎng)的重組人CYP2C9酵母菌菌液20 ml（約含酵母菌10 g），加入含有200 ml SD-His培養(yǎng)基的500 ml三角培養(yǎng)瓶中復(fù)蘇2 d（30℃，200 r/min）。離心除去SD-His培養(yǎng)基，按菌重與緩沖液體積比1∶1加入酵母微粒體緩沖液，渦旋使之充分混懸。將混懸液分裝入2 ml EP管中，使得每個EP管中含有1 ml混懸液（約含酵母菌0.5 g），并分別加入不同量的玻璃珠，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩不同次數(shù)，離心（1000 g，10 min）取上清，再次離心（5000 g，1 h）取上清，上清即為重組人CYP2C9酵母微粒體混懸液[16]。玻璃珠用量分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g，渦旋振蕩次數(shù)分別為10、20、30、40、50、60、70次（每次渦旋振蕩30 s，冰上冷卻60 s）。渦旋振蕩次數(shù)和玻璃珠用量的默認(rèn)值分別為30次和0.5 g。

1.2.4重組人CYP2C9酵母微粒體中蛋白含量的測定

利用Lowry蛋白濃度測定試劑盒及分光光度計，測定不同濃度的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的A650值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所制備重組人CYP2C9酵母微粒體混懸液中的蛋白含量。操作步驟參照Lowry法蛋白濃度測定試劑盒說明書[17]。

1.2.5重組人CYP2C9酵母微粒體蛋白活性的測定

在模擬體內(nèi)環(huán)境下，利用CYP2C9典型底物雙氯芬酸的代謝反應(yīng)，來驗(yàn)證所制備酵母微粒體的蛋白活性，并利用雙氯芬酸經(jīng)CYP2C9代謝的代謝物4-羥基雙氯芬酸的生成量，來量化不同制備條件下所制備的微粒體蛋白活性。

酵母微粒體反應(yīng)在48孔板中進(jìn)行，每孔加入不同條件制備的重組人CYP2C9酵母微粒體356 μl及NADPH再生系統(tǒng)A液（NADP+ 26.1 mmol/L，6磷酸葡萄糖66.0 mmol/L，氯化鎂66.0mmol/L）20 μl和B液（6磷酸葡萄糖脫氫酶40 U/ml）4 μl，預(yù)溫孵10 min。加入20 μl底物雙氯芬酸進(jìn)行反應(yīng)，底物終濃度為25 μmol/L。

不同條件制備的微粒體各設(shè)置三組（n=3），同時設(shè)置對照組（未轉(zhuǎn)染酵母微粒體組）。反應(yīng)在37℃搖床中進(jìn)行，分別于0 h和1 h取樣100 μl，加入500 μl冰乙酸乙酯中進(jìn)行淬滅反應(yīng)，同時加入10 μl 30 μg/ml內(nèi)標(biāo)卡馬西平。渦旋振蕩3 min，離心取上清400 μl，吹干，并用100 μl甲醇復(fù)溶，用HPLC法測定復(fù)溶液中4-羥基雙氯芬酸的峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算重組人CYP2C9酵母微粒體反應(yīng)體系中4-羥基雙氯芬酸的生成量。

1.2.6 HPLC色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸=51∶49∶0.1;流速：1.0 ml/min;檢測波長：280 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μl。

2結(jié)果

2.1利用HPLC測定酵母微粒體反應(yīng)體系中雙氯芬酸及其代謝物的含量

圖1是重組人CYP2C9酵母微粒體（制備條件為渦旋振蕩30次，0.5 g玻璃珠）反應(yīng)0 h和1 h樣品及未轉(zhuǎn)染酵母微粒體反應(yīng)0 h和1 h樣品的HPLC檢測結(jié)果色譜圖。雙氯芬酸、代謝物4-羥基雙氯芬酸及內(nèi)標(biāo)卡馬西平在“1.2.6”項的HPLC色譜條件下分離度良好，保留時間分別為11.08 min、5.13 min和3.74 min。

僅在重組人CYP2C9酵母微粒體反應(yīng)1 h的樣品HPLC圖譜中發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸代謝物4-羥基雙氯芬酸的色譜峰，而其他樣品的HPLC圖譜中未出現(xiàn)此峰。

2.2渦旋振蕩次數(shù)對重組人CYP2C9酵母微粒體蛋白活性的影響

探討渦旋振蕩次數(shù)對所制備微粒體蛋白活性的影響時，玻璃珠的用量為0.5 g。隨著渦旋振蕩次數(shù)的增加，所制備酵母微粒體蛋白含量呈增加趨勢，在渦旋振蕩次數(shù)為50次時，蛋白含量趨于穩(wěn)定，約為22.49 mg/ml。代謝物4-羥基雙氯芬酸的生成量在渦旋振蕩次數(shù)為30次時最大，為1.82 μg（，且單位時間單位蛋白所生成的代謝物量也最大，為0.10 μg/[（mg/ml）·h]，隨后都呈下降趨勢。

2.3玻璃珠用量對重組人CYP2C9酵母微粒體蛋白活性的影響

探討玻璃珠用量對所制備微粒體蛋白活性的影響時，渦旋振蕩次數(shù)為30次。隨著玻璃珠用量的增加，所制備酵母微粒體蛋白含量呈增加趨勢，但不明顯，玻璃珠量為0.75 g時，蛋白含量趨于穩(wěn)定，為19.2 mg/ml。代謝物4-羥基雙氯芬酸的生成量在玻璃珠量為0.75 g時最大，為1.21 μg，單位時間單位蛋白所生成的代謝物量在玻璃珠量為0.5 g和0.75 g時最大，均為0.06 μg/[（mg/ml）·h]。

3討論

酵母細(xì)胞壁厚實(shí)[18]，影響胞內(nèi)外物質(zhì)的接觸，因此細(xì)胞破壁對提高酵母利用率非常重要。目前常用的酵母破壁方法有酶解法[19]、超聲波破碎法[20]、勻漿破碎法[21]和玻璃珠破碎法[22]等，其中玻璃珠破碎法具有操作簡單，可以同時處理多個樣品，且對酶活力和環(huán)境的損害較小等優(yōu)點(diǎn)[23]。Donnell等[24]比較了玻璃勻漿器、珠磨機(jī)、超聲破碎和玻璃珠渦旋振蕩等7種破碎莢膜葡萄球菌酵母細(xì)胞壁提取鋅金屬蛋白的方法，結(jié)果表明玻璃珠渦旋振蕩的方法對提取鋅金屬蛋白最有利，蛋白變性量最小。制備重組人代謝酶酵母微粒體通常也是采用玻璃珠渦旋振蕩的方法[13-16]。為了保留較強(qiáng)的蛋白活性，避免微粒體蛋白因長時間渦旋振蕩產(chǎn)熱而失活，本研究采用渦旋振蕩30 s，冰上冷卻60 s的方式，重復(fù)多次渦旋振蕩。研究結(jié)果顯示，所有不同條件制備的重組人CYP2C9酵母微粒體蛋白均具有一定的活性。

研究結(jié)果顯示，隨著渦旋振蕩次數(shù)的增加，所制備微粒體總量呈現(xiàn)飽和性，當(dāng)渦旋振蕩次數(shù)為40次以上時，接近飽和值。而酶活力在渦旋振蕩次數(shù)為30次時出現(xiàn)峰值，隨后顯著下降，這與盧俊文等[25]的研究結(jié)果相似，筆者認(rèn)為可能是因?yàn)闇u旋振蕩30次以后，微粒體總量趨于飽和，此時玻璃珠除了破碎酵母細(xì)胞，還會破碎已制備的微粒體細(xì)胞。而渦旋振蕩次數(shù)為最佳值30次時，除了0.25 g以外，玻璃珠用量對所制備微粒體總量無明顯影響，酶活性在玻璃珠用量為0.5 g和0.75 g時出現(xiàn)峰值。因?yàn)椴Ａе橛昧繛?.75 g時，代謝物的生成量較高，因此玻璃珠用量為0.75 g時的破碎效果最佳。當(dāng)玻璃珠量大于0.75 g時，酶活性顯著下降，筆者認(rèn)為可能是玻璃珠過量破碎了微粒體，使蛋白部分失活所致。

綜上所述，玻璃珠破碎法制備酵母微粒體的最佳條件為渦旋振蕩30次（每次渦旋振蕩30 s，冷卻60 s）和0.75 g玻璃珠。本研究結(jié)果將為建立更加靈敏快捷的體外代謝篩選模型提供依據(jù)。