張學(xué)雯 王奕丁 李紅亞

摘要：采用酸沉醇提法從菌株B10-6-1發(fā)酵液中提取脂肽類抗生素粗提物，采用抑菌圈法確定其最低抑菌濃度及抑菌譜，考察溫度、pH、蛋白酶、金屬離子、EDTA等因素對(duì)其抑菌活性的影響;通過孢子萌發(fā)法和顯微觀察法考察脂肽類抗生素粗提物對(duì)黃曲霉（Aspergillus flavus）菌孢子萌發(fā)和菌絲的作用。結(jié)果表明，脂肽類抗生素粗提物的最低抑菌濃度為4 g/L，在40 ℃，pH為8時(shí)抑菌活性最高;溫度、pH、蛋白酶、金屬離子、EDTA對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性都沒有較明顯的影響;該粗提物抑菌譜廣泛，對(duì)白菜黑斑菌、小麥紋枯菌等9株真菌都有明顯抑制作用。脂肽類抗生素粗提物處理菌絲可使菌絲細(xì)胞壁出現(xiàn)消融，并使孢子的萌發(fā)率降低，即該物質(zhì)是通過抑制黃曲霉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)起到抑菌作用的。

關(guān)鍵詞：黃曲霉（Aspergillus flavus）拮抗菌;脂肽類抗生素粗提物;性質(zhì)鑒定;抑菌機(jī)理

中圖分類號(hào)：S476? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）14-0070-06

Abstract： The crude lipopeptide extract was extracted from the fermentation broth of strain B10-6-1 by acid precipitation. The minimum inhibitory concentration and the antimicrobial spectrum were determined by the inhibition circle method. The effects of temperature， pH， protease， metal ions， EDTA and other factors on the bacteriostatic activity were investigated. The effects of crude lipopeptide extracts on Aspergillus flavus spore germination and hyphae were investigated by spore germination and microscopic observation. The results showed that the minimum inhibitory concentration of crude lipopeptide extract was 4 g/L， with the highest inhibitory activity at 40 ℃ and pH of 8， while temperature， pH， protease， metal ion and EDTA had no obvious effect on the antibacterial activity of crude lipopeptide extract. The antifungal spectrum of the crude extract was extensive and had obvious inhibitory effect on 9 strains of fungi such as Alternaria brassicae and Rhizoctonia cerealis etc. The mycelium treated with lipopeptide extract could dissolve the site of mycelium cell wall and decrease the germination rate of spores， which could inhibit the germination of Aspergillus flavus spores and the growth of hyphae.

Key words： Aspergillus flavus antagonistic bacteria; crude extract of lipopeptide antibiotics; characterization; antibacterial mechanism

黃曲霉（Aspergillus flavus）菌在自然界中分布廣泛，它主要的危害是感染玉米、花生和其他糧食作物，產(chǎn)生黃曲霉毒素[1，2]。黃曲霉毒素是毒性最強(qiáng)且能夠引起生物污染的生物毒素之一，會(huì)對(duì)人體和動(dòng)物的肝臟造成嚴(yán)重?fù)p害，低于1 mg/kg即可導(dǎo)致半數(shù)致死[3，4]。

在對(duì)黃曲霉菌的防治中，生物防治技術(shù)受到了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的青睞。它與化學(xué)防治方法相比，具有顯著的抗菌效果，且對(duì)環(huán)境友好，是減少或完全清除黃曲霉菌污染最有前景的方法[5]。迄今為止，已有不少研究者從曲霉、芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌中篩選出了能夠抑制黃曲霉菌的菌株[6-9]。其中，芽孢桿菌因?yàn)榭梢陨a(chǎn)多種酶和抗生素，對(duì)人和動(dòng)物無毒無害，具有廣譜的抗菌活性和強(qiáng)大的抗菌性能等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)之中[10-14]。

目前，國(guó)內(nèi)外許多科學(xué)家致力于黃曲霉拮抗菌拮抗物性質(zhì)和抑菌機(jī)理的研究，且取得了可喜進(jìn)展。已有文獻(xiàn)報(bào)道黃曲霉拮抗菌拮抗物大多為蛋白質(zhì)，并對(duì)其抑菌譜、性質(zhì)及抑菌機(jī)理進(jìn)行了研究。李金芝[15]發(fā)現(xiàn)空氣芽孢桿菌Y-17-3的蛋白粗提液對(duì)溫度和pH非常敏感，可以抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)。章挺等[16]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B-SF06蛋白粗提液有廣譜抑制真菌活性，對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著抑制作用，且不會(huì)受到溫度和酸堿度影響。也有學(xué)者報(bào)道其他的抗菌物質(zhì)，如周啟升等[17]發(fā)現(xiàn)拮抗鏈霉菌S24產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為多烯類，主要成分由四烯和五烯兩類多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素組成，能夠有效抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)及孢子的萌發(fā)。也有拮抗菌產(chǎn)生脂肽類抗生素的報(bào)道，如Moyne等[18]從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分離到2種質(zhì)量相近的脂肽類抗生素，可以有效抑制黃曲霉生長(zhǎng)。但關(guān)于脂肽類抗生素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及作用機(jī)制，尚缺乏深入研究。

前期試驗(yàn)中已經(jīng)篩選出一株黃曲霉拮抗菌B10-6-1（Bacillus amyloliqufaciens），經(jīng)酸沉醇提法探明其拮抗物質(zhì)不是蛋白類，而是脂肽類抗生素，且其抑菌活性顯著高于已有菌株，具有開發(fā)成新型生物農(nóng)藥的潛力。關(guān)于脂肽類抗生素的報(bào)道較少，因此，有必要對(duì)其性質(zhì)及抑菌機(jī)理進(jìn)行深入研究，結(jié)果可為黃曲霉拮抗菌B10-6-1的進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用，以及黃曲霉抑制劑的開發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌種? 黃曲霉菌株由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所花生研究室饋贈(zèng)。黃曲霉拮抗菌B10-6-1由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系篩選并保藏。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基參見文獻(xiàn)[19]。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉3.0 g，黃豆餅粉2.0 g，氯化鉀0.13 g，無菌水1 000 mL。

1.2? 方法

1.2.1? 發(fā)酵培養(yǎng)? 挑取菌株B10-6-1的菌苔轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)12 h得到種子液。將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)72 h得發(fā)酵液。

1.2.2? 脂肽類抗生素粗提物的制備? 脂肽類粗提物的提取采用酸沉和甲醇提取的方法。將上述發(fā)酵液于4 ℃，8 000 ×g離心20 min除去菌體，上清液用6 mol/L的濃鹽酸調(diào)pH至2.0，在4 ℃環(huán)境下靜置過夜，8 000×g離心20 min得沉淀，沉淀用甲醇抽提2次，8 000×g離心15 min除去沉淀。合并甲醇抽提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇后，即為脂肽類抗生素粗提物[20]。

1.2.3? 脂肽類抗生素粗提物的最低抑菌濃度? 以二倍稀釋法稀釋脂肽類抗生素粗提物，將其制成不同濃度（32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 g/L），采用打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)：在黃曲霉菌的混菌平板小孔內(nèi)加入70 μL上述待測(cè)溶液，將該病原菌平板置于28 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察抑菌效果，測(cè)定抑菌圈直徑大小。當(dāng)沒有明顯的抑菌圈出現(xiàn)時(shí)，則可將此濃度視為最低抑菌濃度。

1.2.4? 金屬離子對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響? 將脂肽類抗生素粗提物溶于0.02 mol/L，pH 7.0的Tris-HCl緩沖液中，配制60 g/L的粗提液若干份，分別加入等體積的KCl、CaCl2、MnCl2、FeCl3、ZnCl2、NaCl、CuSO4母液，使金屬離子濃度分別為25、50 mmol/L，加入無菌水作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.5? EDTA對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響? 向質(zhì)量濃度為60 g/L脂肽類抗生素的粗提液中分別加入等體積濃度為6.25、12.50、25.00、50.00 mmol/L的EDTA溶液，加入無菌水作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.6? pH對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響? 將脂肽類抗生素粗提物用0.05 mol/L，pH分別為4.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH為10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液溶解，使最終質(zhì)量濃度為30 g/L。用無菌水作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7? 溫度對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響? 將質(zhì)量濃度為30 g/L的脂肽類抗生素粗提物經(jīng)40、60、80和100 ℃水浴處理30 min，與室溫（25 ℃）條件下的抑菌活性進(jìn)行比較，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.8? 蛋白酶對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響? 向質(zhì)量濃度為60 g/L的脂肽類抗生素粗提液中加入等體積胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液，使脂肽類抗生素粗提物質(zhì)量濃度為30 g/L，胃蛋白酶和胰蛋白酶的最終質(zhì)量濃度為1 g/L。37 ℃孵育2 h，將體系加熱至80 ℃維持10 min使酶失活終止反應(yīng)。以相同濃度的未經(jīng)蛋白酶處理的脂肽類抗生素粗提物作對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.9? 脂肽類抗生素粗提物的抑菌譜? 將質(zhì)量濃度為30 g/L的脂肽類抗生素粗提液進(jìn)行小麥紋枯菌、棉花枯萎病菌、禾谷鐮刀菌、層出鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、棉花黃萎菌、蘋果斑點(diǎn)病菌、白菜黑斑病菌、惡疫霉的抑菌試驗(yàn)[21]。

1.2.10? 黃曲霉拮抗菌株B10-6-1抑菌機(jī)理測(cè)定? 將黃曲霉菌餅轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)10 d后采用G2垂熔漏斗過濾發(fā)酵液，取過濾液置于滅菌試管中，振蕩，采用滅菌培養(yǎng)基將其濃度稀釋至107 CFU/mL，得到供試病原菌孢子懸液;漏斗上方菌絲用無菌培養(yǎng)液沖洗至無菌平皿中，在漏斗中過濾幾遍，直到鏡檢視野里幾乎看不到孢子，即得到純凈供試病原菌菌絲。菌絲與孢子液分別進(jìn)行美藍(lán)（亞甲基藍(lán)）染色。

1.2.11? 脂肽類抗生素粗提物對(duì)黃曲霉孢子的影響? 用無菌水溶解脂肽類抗生素粗提物，將其配制成如下濃度：50.00、25.00、12.50、6.25 g/L。將上述溶液與孢子液等體積混合均勻，貼上標(biāo)簽并標(biāo)記。28 ℃條件下培養(yǎng)，于0、24、48、72、96 h分別鏡檢，顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況，并在48 h時(shí)，各取100 μL分別均勻涂布于PDA平板中，以加入等體積無菌水的孢子液作對(duì)照，每組3個(gè)平行，于72 h觀察并記錄各平板中的菌落數(shù)。

1.2.12? 脂肽類抗生素粗提物對(duì)黃曲霉菌絲的影響? 將“1.2.11”的孢子液換成菌絲液，28 ℃培養(yǎng)，0、24、48、72、96 h分別鏡檢，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化，并在96 h后凍干，稱重并記錄菌絲的重量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 脂肽類抗生素粗提物的最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法測(cè)定到菌株B10-6-1脂肽類抗生素粗提物最低抑菌濃度為4 g/L（圖1）。

2.2? 金屬離子對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響

由圖2可知，與對(duì)照相比金屬離子Cu2+、Fe3+、Na+對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性基本無影響，25 mmol/L金屬離子Mn2+、50 mmol/L金屬離子Mn2+、Ca2+、K+可使脂肽類抗生素粗提物的抑菌活性分別提高7.5%、10.0%、7.5%、6.5%。

2.3? EDTA濃度對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性的影響

由圖3可知，與對(duì)照相比，濃度為6.25、12.50、25.00、50.00 mmol/L的EDTA對(duì)脂肽類抗生素粗提物的抑菌活性無明顯影響。

2.4? pH對(duì)脂肽類抗生素粗提物抗菌活性的影響

由圖4可知，與對(duì)照相比，pH為6.0、7.0時(shí)對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性無明顯影響，pH為4.0時(shí)抗菌活性降低42.4%，在pH為8.0、10.0時(shí)抗菌活性分別增強(qiáng)9.1%、3.0%。

2.5? 溫度對(duì)脂肽類抗生素粗提物抗菌活性的影響

由圖5可知，與對(duì)照相比，溫度對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性影響不大，但經(jīng)40 ℃處理的脂肽類抗生素粗提物抑菌活性提高9.7%，經(jīng)100 ℃處理的脂肽類抗生素粗提物抑菌活性保留90.3%，由此可知該脂肽類抗生素粗提物的耐熱性較好。

2.6? 蛋白酶對(duì)脂肽類抗生素粗提物抗菌活性的影響

由圖6可知，與對(duì)照相比，經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶處理過的脂肽類抗生素粗提物抑菌活性無明顯影響。

2.7? 脂肽類抗生素粗提物的抑菌譜

如圖7所示，菌株B10-6-1脂肽類抗生素粗提物對(duì)所測(cè)的惡疫霉菌、層出鐮刀菌、小麥紋枯病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、尖孢鐮刀菌、白菜黑斑病菌、禾果鐮刀菌、蘋果斑點(diǎn)病菌等9種真菌均有較明顯的抑菌活性。其中，對(duì)層出鐮刀菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為（1.730±0.871） cm，對(duì)其余真菌的抑菌圈直徑均超過2.00 cm，對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌效果最差，抑菌圈直徑為（3.300±0.951） cm（表1）。

2.8? 脂肽類抗生素粗提物對(duì)黃曲霉菌孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，脂肽類抗生素粗提物能夠抑制黃曲霉菌孢子萌發(fā)，且隨著脂肽類抗生素粗提物濃度的增加，黃曲霉菌孢子的萌發(fā)率逐漸下降，即抑制作用增強(qiáng)。

由顯微鏡觀察可知，與對(duì)照（圖8A）相比，脂肽類抗生素粗提物作用于黃曲霉孢子后，出現(xiàn)孢子壁溶化，原生質(zhì)體溶解，內(nèi)容物分布不均、變形、空腔等異常（圖8B、圖8C）。且隨著脂肽類抗生素粗提物濃度的增加，孢子數(shù)明顯減少，死亡數(shù)明顯增多，而不添加脂肽類抗生素粗提物的孢子（對(duì)照）正常萌發(fā)（圖8A）。

2.9? 脂肽類抗生素粗提物對(duì)黃曲霉菌絲的影響

稱重結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，隨著脂肽類抗生素粗提物濃度的升高，黃曲霉菌絲干重減少，即隨著脂肽類抗生素粗提物濃度的升高黃曲霉菌絲生長(zhǎng)受到的抑制作用增強(qiáng)。

鏡檢得知，不加脂肽類粗提液的黃曲霉菌絲正常生長(zhǎng)，菌絲光滑，修長(zhǎng)（圖9A）;而加脂肽類粗提液的黃曲霉菌菌絲形態(tài)異常，出現(xiàn)變粗、扭曲、皺裙、膨大、內(nèi)容物流出、細(xì)胞壁消融等現(xiàn)象;且隨著脂肽類抗生素粗提物濃度的增加，菌絲內(nèi)膨大物增多，膨大扭曲加劇;原生質(zhì)消融，出現(xiàn)透明條帶;隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，最終菌絲體壁破裂乃至消融（圖9B、圖9C）。

3? 小結(jié)與討論

黃曲霉拮抗菌B10-6-1的脂肽類抗生素粗提物，最低抑菌濃度為4 g/L，在40 ℃，pH為8時(shí)抑菌活性最高，金屬離子、EDTA濃度、溫度、pH、蛋白酶對(duì)脂肽類抗生素粗提物抑菌活性都沒有較明顯的影響，其對(duì)白菜黑斑菌、小麥紋枯菌等9種真菌都有明顯抑制作用，該物質(zhì)通過抑制病原菌的孢子萌發(fā)和促使菌絲溶解斷裂來發(fā)揮抑菌作用。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于芽孢桿菌的抗菌蛋白研究較多，脂肽類抗生素的報(bào)道相對(duì)較少且對(duì)其研究仍處于探索階段[22，23]。芽孢桿菌抗菌蛋白一般具有抗真菌和細(xì)菌等特性，其抗菌譜廣，穩(wěn)定性高，對(duì)熱、酶敏感。相比蛋白而言，小肽有許多獨(dú)特特征：分子量很小，基本都是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含有一些特殊氨基酸，具有耐受高溫和蛋白酶的作用等[24]。本研究中，菌株B10-6-1所產(chǎn)脂肽類抗生素對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，這與張寶俊等[25]研究的解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白和解淀粉芽孢桿菌Q-12抗菌蛋白均對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感不相同。對(duì)此結(jié)果進(jìn)行分析，蛋白酶可以催化蛋白質(zhì)水解，能將肽鍵分解成酸與胺兩部分，胰蛋白酶僅能分解賴氨酸和精氨酸的肽鍵。胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵。據(jù)此推斷本試驗(yàn)的脂肽類抗生素不含相應(yīng)肽鍵，因此對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

本研究的脂肽類抗生素在40～100 ℃熱穩(wěn)定性良好，且該物質(zhì)有較寬的pH范圍，較耐酸堿性。此結(jié)果與馬俊美等[26]側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9所產(chǎn)脂肽類抗生素試驗(yàn)結(jié)果相同，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該脂肽類抗生素具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明，此脂肽類抗生素不易受外界環(huán)境的影響，可以較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮生物學(xué)的作用，具有廣闊的研究和應(yīng)用價(jià)值。由此推測(cè)本試驗(yàn)的脂肽類抗生素屬于小分子肽類，其性質(zhì)可能與它的分子量小和環(huán)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。

通過脂肽類抗生素對(duì)黃曲霉菌絲的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌絲發(fā)生崎形、扭曲，同時(shí)菌絲外壁的完整性出現(xiàn)嚴(yán)重破壞，內(nèi)容物滲出，說明脂肽類抗生素對(duì)病原菌細(xì)胞壁與質(zhì)膜的破壞是主要作用機(jī)理之一。王宇婷等[27]報(bào)道了脂肽類抗生素可影響真菌細(xì)胞壁的合成，造成真菌菌絲頂端膨大、不能正常生長(zhǎng)，表明作用于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜是脂肽類抗生素作用機(jī)制之一。脂肽類抗生素作用于細(xì)胞外基質(zhì)生物大分子，包括抑制肽聚糖、幾丁質(zhì)的完整性，以及影響肽聚糖等大分子的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、交聯(lián)等，而這些生物大分子的合成、完整性是菌體保持正常功能的必要條件。除對(duì)細(xì)胞壁造成影響外，脂肽類抗生素還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜功能紊亂，如菌體細(xì)胞膜去極化，進(jìn)而離子和代謝產(chǎn)物泄露，呼吸作用等其他基本功能喪失直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28-30]。為了進(jìn)一步探明脂肽類抗生素作用機(jī)制，本試驗(yàn)后期擬進(jìn)入如下研究：從空間構(gòu)象的角度研究，探明脂肽類抗生素對(duì)細(xì)胞膜的作用方式;從化學(xué)物質(zhì)的角度研究，探明脂肽類抗生素細(xì)胞外基質(zhì)生物大分子合成與表達(dá)的方式;從分子生物學(xué)的角度研究，探明脂肽類抗生素與胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用。

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