吳位珩，楊莉，姜玲玲，孫啟躍，張濤，徐景峨，劉鏡，楊茂生，余波，黃波，唐遠(yuǎn)江

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005）

牛運(yùn)輸應(yīng)激綜合征是長途販運(yùn)過程中多種應(yīng)激原，如熱、冷、風(fēng)、雨、饑、渴、擠壓、驚嚇、顛簸、合群、調(diào)料、體力耗費(fèi)、環(huán)境改變、潛在疾病等，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，病原微生物(如支原體、巴氏桿菌、大腸桿菌等）趁虛而入，引起呼吸道、消化道，乃至全身病理性反應(yīng)的綜合征候群[1]。近年來，隨著貴州省攻堅(jiān)扶貧的推進(jìn)，各級政府堅(jiān)持把產(chǎn)業(yè)扶貧作為精準(zhǔn)脫貧的重要抓手，把畜牧業(yè)作為推進(jìn)精準(zhǔn)扶貧、精準(zhǔn)脫貧的重要產(chǎn)業(yè)來抓，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出持續(xù)、快速、健康發(fā)展的良好態(tài)勢。在此形勢下，肉牛引進(jìn)量不斷增大，但也帶來了一系列流行病感染問題，其中肉牛運(yùn)輸綜合征最為突出，給貴州省養(yǎng)牛生產(chǎn)造成了很大的損失。對此，項(xiàng)目組于2018年3～6月，對貴州省黔西縣引進(jìn)的能繁安格斯母牛進(jìn)行了肉牛運(yùn)輸綜合征發(fā)生情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)造成肉牛運(yùn)輸綜合征的主要病因是牛支原體感染，且易繼發(fā)和混合其他病原感染（如巴氏桿菌、寄生蟲病等），嚴(yán)重的可造成死亡。根據(jù)牛支原體OPPD／F基因序列保守區(qū)間設(shè)計(jì)引物，建立了牛支原體PCR診斷方法，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及病原菌分離鑒定，對發(fā)生的疾病進(jìn)行確診，初步摸清貴州省肉牛運(yùn)輸綜合征發(fā)生情況，并制定出肉牛運(yùn)輸綜合征預(yù)防和治療措施，取得了較好效果?，F(xiàn)將具體情況介紹如下。

1 發(fā)病情況

2018年3月以來，恒大集團(tuán)在貴州黔西縣開展了產(chǎn)業(yè)扶貧的重點(diǎn)項(xiàng)目——發(fā)展安格斯牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，從澳大利亞引進(jìn)安格斯能繁母牛6 900頭。由于缺乏引進(jìn)大批國外牛群的經(jīng)驗(yàn)，牛到場2～3d，出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征，其中死亡6頭，130多頭牛癥狀較嚴(yán)重，其余癥狀較輕，僅出現(xiàn)咳嗽、流黏性鼻液、結(jié)膜炎等現(xiàn)象。對此，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所科研人員進(jìn)行了調(diào)研、取樣、實(shí)驗(yàn)室分離診斷和藥物敏感試驗(yàn)，并制定出防治對策，指導(dǎo)牛場采取了有效的防治措施，取得較好的效果，牛群健康恢復(fù)穩(wěn)定。

2 發(fā)病牛臨床癥狀表現(xiàn)

病牛體溫升高、精神沉郁、食欲減退、被毛粗亂，出現(xiàn)咳嗽、氣喘、流黏性或膿性鼻液、拉稀、血便、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等癥狀，重癥病牛極度消瘦，最后衰竭死亡。解剖死亡牛只，肺部有干酪樣壞死灶或化膿性壞死灶，胸腔內(nèi)有大量纖維性滲出液或膿性液體，部分出現(xiàn)肺與胸腔粘連、消化道潰瘍等病癥。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 樣本的采集

無菌采集病死牛樣本心、肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等和發(fā)病牛鼻黏液樣本，即鼻拭子，放置于有冰袋的采樣箱中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行分離培養(yǎng)、PCR檢測等。

3.2 實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)

3.2.1 支原體的分離培養(yǎng)

將牛肺樣本置于平皿中，無菌水沖洗3次，取中間部分，研磨，備用；鼻拭子用1mL生理鹽水浸潤，棄去藥棉棒。將處理好的牛肺和鼻拭子用0.45μm濾膜過濾后接種于PPLO肉湯培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基由紅變黃時(shí)轉(zhuǎn)接于PPLO固體培養(yǎng)基中，經(jīng)5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)72h后，可見針尖大小、邊緣整齊、“油煎蛋狀”菌落[2,3]。

3.2.2 巴氏桿菌的分離培養(yǎng)

將病料組織（心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等），接種于10%犢牛血清肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，此時(shí)肉湯均勻混濁，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于10%犢牛血清固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，可見灰白色、露珠狀、針尖大小的菌落，美藍(lán)染色鏡檢可見典型的兩極著色、革蘭氏染色為陰性的小桿狀細(xì)菌[4]。

3.3 支原體PCR診斷

3.3.1 參考菌株

牛支原體菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、結(jié)核分枝桿菌均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室提供。

3.3.2 引物

根據(jù)牛支原體OPPD／F基因序列，應(yīng)用Primer Primer5.0基因分析軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：

上引物：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT- 3’，下引物：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC- 3’。

3.3.3 樣本DNA的提取

（1）組織樣本DNA的提?。喝∨７紊僭S，剪碎，加入900μL生理鹽水，反復(fù)凍融3次，5 000r/min離心5min，取上清液，加20μL蛋白酶K，100μL10%SDS液，55℃水浴至完全消化，冷卻，備用。取1mL鼻拭子處理液，10 000r/min離心2min，收集沉淀。將處理好的樣品液按核酸提取Mini試劑盒說明書操作提取模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）分離培養(yǎng)菌株DNA的提?。喝?.5mL菌液，10 000r/min離心2min，棄上清，收集沉淀。按核酸提取Mini試劑盒說明書操作提取模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3.4 牛支原體特異性片段的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件分別見表1、表2。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果見圖1。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

3.3.5 PCR法擴(kuò)增的敏感性測定

采用TU-1800spc紫外可見光光度計(jì)，取OD值為260nm，將牛支原體DNA模板稀釋100倍，測量濃度。根據(jù)模板濃度（μg/μL）=A260×稀釋倍數(shù)×50/1000進(jìn)行計(jì)算。測得牛支原體標(biāo)準(zhǔn)模板的OD260值為0.633nm，計(jì)算得出，提取的牛支原體標(biāo)準(zhǔn)DNA含量為0.5μg/μL。進(jìn)行敏感性試驗(yàn)時(shí)，按10稀釋法對DNA模板進(jìn)行稀釋，取2μL模板進(jìn)行擴(kuò)增，則牛支原體標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度依次為1μg/μL、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7μg/μL。在PCR反應(yīng)中，可檢出的牛支原體標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的含量最小是10-7μg/μL，即靈敏度為10-7μg/μL（圖2）。

圖1 牛支原體 PCR反應(yīng)結(jié)果

圖2 牛支原體PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.6 PCR法擴(kuò)增的特異性測定

分別用標(biāo)準(zhǔn)牛支原體菌株、嗜血桿菌、魏氏梭菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。除牛支原體出現(xiàn)擴(kuò)增帶，其他的菌株未見特異性226bp片段擴(kuò)增（圖3）。

圖3 牛支原體PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.7 臨床樣品的檢測

2018年3～6月，筆者所在團(tuán)隊(duì)采集黔西縣金碧牛場、觀音洞牛場、大關(guān)牛場、七里牛場牛肺樣本和鼻拭子共163份，檢出陽性樣本60份，且與細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果一致，同時(shí)將PCR擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收，送大連寶生物工程有限公司測序，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段為牛支原體的特異性條帶（圖4）。

圖4 臨床樣本的檢測結(jié)果

3.4 牛巴氏桿菌PCR診斷

采用建立的多殺性巴氏桿菌(P m) P C R診斷方法，對1 0%犢牛血清培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物進(jìn)行P C R擴(kuò)增，結(jié)果可見在2 7 5 b p出現(xiàn)目標(biāo)帶，判斷為陽性（圖5）。引物的序列為：P m 1 5'-TGATTAGTGAGCCGAGTAAG-3'；Pm2 5'-TGGTGCGTTATTGTTGTTG-3'。

圖5 牛巴氏桿菌PCR反應(yīng)結(jié)果

3.5 牛疥癬病的診斷

根據(jù)養(yǎng)殖場的發(fā)病情況、結(jié)合臨床癥狀可以對病情進(jìn)行初步診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷如下：在患病?；疾〔课缓徒】挡课唤唤缣?，用經(jīng)過消毒的凸刃小刀沿著牛體表垂直方向刮取牛皮屑組織，直到皮膚組織輕微出血為止，將皮屑組織放入到試管中，向其中加入10%氫氧化鈉溶液充分加熱，等到皮屑溶解之后，取沉淀物制成涂片，用100倍顯微鏡觀察，此時(shí)可發(fā)現(xiàn)成蟲和黃白色蟲卵。成蟲身體呈圓形，似龜狀，微黃白色，背面隆起，腹面扁平。將收集到的皮屑組織放在白紙上，加熱皮屑，隨著溫度的升高可以看到有成蟲從皮屑組織爬出，長度在0.33～0.45mm，軀體分為背胸部和背腹部，軀體前方有1假頭，軀體腹面有4對短而粗的足，由此可以確診為牛疥癬病。

3.6 診斷結(jié)論

通過試驗(yàn)，結(jié)合臨床癥狀，確診為牛支原體肺炎，嚴(yán)重的繼發(fā)牛出?。ㄅ０褪蠗U菌?。斐伤劳?。另外，由于引進(jìn)牛部分患有疥癬，運(yùn)輸綜合征的發(fā)生加劇了疥癬的感染。

4 藥物敏感試驗(yàn)

將分離的菌株進(jìn)行藥敏試紙抑菌試驗(yàn)。試驗(yàn)用藥敏試紙有：呋喃妥因、頭孢曲松、利福平、頭孢西丁、呋喃唑酮、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、青霉素G、林可霉素、頭孢呋辛、阿莫西林、頭孢噻肟、新霉素、頭孢哌酮、四環(huán)素、鏈霉素、頭孢唑啉、卡那霉素、氟苯尼考（購自杭州濱和微生物試劑有限公司，生產(chǎn)許可證：20100290號）。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)按產(chǎn)品說明書規(guī)定進(jìn)行，支原體藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)條件同支原體分離培養(yǎng)，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷藥物敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照產(chǎn)品說明。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同牛場分離的牛支原體藥敏特性有較大差異，菌株對新霉素、氟苯尼考敏感，部分菌株對鏈霉素、四環(huán)素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素較敏感，對呋喃妥因、頭孢曲松、利福平、頭孢西丁、呋喃唑酮、氨芐西林、青霉素G、林可霉素、頭孢呋辛、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢唑啉不敏感。

5 防治措施

5.1 治療

肺部感染嚴(yán)重，并伴有高熱及關(guān)節(jié)炎癥狀的，肌注新霉素或者氟苯尼考，5d為一療程。若出現(xiàn)混合感染多種病原現(xiàn)象時(shí)，治療時(shí)也可采用四環(huán)素、慶大霉素、地塞米松合并用藥，采用葡萄糖和維生素C進(jìn)行補(bǔ)液，5～7d為一個(gè)療程。若伴有消化道癥狀，可肌注氟本尼考，腸炎出血的靜注止血藥，以葡萄糖和維生素C進(jìn)行補(bǔ)液，5d為一療程。出現(xiàn)結(jié)膜炎癥狀的采用青霉素稀釋后噴霧治療。伴有牛疥癬的，在采取治療肺炎的同時(shí)使用伊維菌素治療，用量為每千克體重0.2mg，皮下注射，間隔1周再用藥1次；同時(shí)，采用1%敵百蟲藥液噴霧淋洗患病牛，用藥前讓牛飲足水，同時(shí)保定好牛，避免牛舔舐藥液，間隔1周再用藥1次。在采用抗生素治療的同時(shí)，課題組還采用了自主研發(fā)的治療呼吸道病的中藥“大白芩散”，配方為大青葉42g、百部15g、黃芩43g，進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合治療，每天一次，連用5d，取得了較好的治療效果。

5.2 綜合防治

5.2.1 嚴(yán)格引進(jìn)新牛

不從疫區(qū)或發(fā)病區(qū)引進(jìn)牛。做好布病、口蹄疫、支原體病、結(jié)核等疾病的檢疫防疫工作，如果要在購買地注射相關(guān)疫苗，應(yīng)隔離現(xiàn)察15～20d后方可裝車。運(yùn)輸車輛要進(jìn)行防滑處理，在車廂內(nèi)鋪干草或者是草墊等，以起到護(hù)蹄、防滑、防摔倒的作用。在運(yùn)牛前要對運(yùn)輸車輛、裝卸牛臺、接收牛場(牛舍)、相關(guān)用具等進(jìn)行全面消毒，可用消毒靈、新潔爾滅、火堿、生石灰等徹底消毒。運(yùn)輸牛的押車人員要選擇有一定經(jīng)驗(yàn)、了解牛習(xí)性的人員，以使牛在途中可以得到精心照料，出現(xiàn)緊急情況時(shí)還能進(jìn)行必要的救治，從而降低牛的應(yīng)激反應(yīng)。運(yùn)輸前按購牛地的飼養(yǎng)習(xí)慣和飼料進(jìn)行飼喂，不能飼喂多汁牧草等易造成腹瀉的飼料，要減少精料喂量。要在裝車前4h左右喂料及飲水，只喂八成飽，以防過飽在途中顛簸傷害腸胃。在運(yùn)輸過程中，要備足草料，按每頭牛5kg/d計(jì)算出草料總量。運(yùn)輸途中汽車的起步或停車要緩慢、平穩(wěn)，中途要?jiǎng)蛩傩旭?，高速路?0～100km/h行駛，其他道路或彎道的地方應(yīng)控制在40～60km/h。長途運(yùn)輸過程中，每行駛2～4h要停車檢查1次，每隔6～8h給牛飲水1次，每天飼喂優(yōu)質(zhì)青干草5kg，盡最大努力減少運(yùn)輸引起的應(yīng)激反應(yīng)。

5.2.2 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

牛場保證良好的衛(wèi)生環(huán)境非常重要，牛舍要保持干燥、清潔、通風(fēng)良好，注意防寒保暖，要定期對肉牛場的設(shè)施設(shè)備進(jìn)行清潔、消毒，控制飼養(yǎng)密度，防止過于擁擠。飼喂品質(zhì)優(yōu)良的飼料，補(bǔ)充適量的精料、微量元素和維生素，確保日糧含有全面、均衡的營養(yǎng)，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。

5.2.3 加強(qiáng)疾病預(yù)防

定期消毒牛舍，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和隔離病牛，做到“早診斷，早治療”，同時(shí)研制并開發(fā)獸用中藥來防控該病的發(fā)生和流行，以確保牛運(yùn)輸遷徒的安全[5～8]。