韓 萍，楊雪枝，趙英杰，張冰潔，李絲雨，張斌斌，常 艷，魏 偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種復(fù)雜的自身免疫病，特征是慢性滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞，發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。色氨酸(L- tryptophan, Trp)是人體必需氨基酸，可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫[2-3]，多數(shù)Trp代謝是沿著犬尿氨酸(L- kynurenine, Kyn)途徑代謝的，該途徑產(chǎn)生Kyn及一系列代謝產(chǎn)物，參與炎癥免疫反應(yīng)[4]。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)模型在病理機(jī)制等方面與人的RA相似，是研究RA較為理想的模型之一[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立AA模型，檢測(cè)正常和模型大鼠血清中Trp和Kyn含量變化，目前主要采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)Trp和Kyn的含量[6-7]，在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線等時(shí)對(duì)使用的血清進(jìn)行了透析，此法可在同時(shí)測(cè)定Trp和Kyn的條件下，減少干擾因素。

1 材料與方法

1.1 樣本動(dòng)物為健康雄性SD大鼠20只，合格證號(hào)：[SCXK(皖)2017-001]，體質(zhì)量(170±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。樣本的收集AA大鼠成模后處死取血于15 ml離心管中，靜置2 h后，2 000 r/min離心20 min，取上清液，并于-20 ℃保存。

1.2 儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Sigma 3- 30K高速冷凍離心機(jī)(上海納騰儀器有限公司)；AA- 200DS電子分析天平(美國(guó)Denver儀器公司)；Amicon Uitra- 0.5超濾離心機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 試劑L- Trp(WXBC4097V)、L- Kyn(BCBT1074)購(gòu)自德國(guó)SIGMA- ALORICH，純度≥98%；冰醋酸(20170106)、醋酸鈉(20170320)、高氯酸(20170204)均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 AA大鼠模型的制備將大鼠隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組和模型組，每組10只。將 BCG 80 ℃水浴滅活1 h，與經(jīng)過(guò)高壓滅菌的石蠟充分研磨，制成10 mg/ml完全弗氏佐劑(complete freund adjuvant,CFA)，于大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA 0.1 ml致炎[8]，正常組用生理鹽水同法注射。

1.5 溶液的配制

1.5.1儲(chǔ)備液配制 精密稱取L- Trp對(duì)照品40.90 mg，L- Kyn對(duì)照品2.08 mg，用體積百分比為2.5%的高氯酸溶解，定容至10 ml容量瓶中，得濃度20 000 μmol/L、1 000 μmol/L對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃保存，用時(shí)稀釋。

1.5.2流動(dòng)相溶液配制 精密稱取醋酸鈉4.922 8 g, 加純水溶解于100 ml容量瓶中定容，制成600 mmol/L儲(chǔ)備液。用時(shí)加純水稀釋得15 mmol/L溶液，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.5.3血清透析 將透析袋在體積2% (w/v) NaHCO3和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10 min，再放在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，冷卻后放于4 ℃。將需要透析的血清裝入透析袋，放入KrebsRinger磷酸鹽緩沖液[78.1% NaCl溶液，2.3% CaCl2-2H2O溶液，3.1% KCl溶液，0.8% MgSO4-7H2O，15.6%Na2HPO4-HCl緩沖液(pH 7.4)]中，血清：緩沖液(1 ∶25，v/v)，于4 ℃透析36 h，緩沖液每8～10 h更換1次，至少更換3次。

1.5.4供試品溶液的配制 取透析血清100 μl于離心管中，加入100 μl 5%高氯酸，充分混勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取20 μl進(jìn)樣。

1.6 色譜條件色譜柱：Agilent TC- C18(250 mm×5 mm, 5 μm)；流動(dòng)相 ∶乙腈 ∶醋酸鈉(體積百分比8 ∶92)；流速1.0 ml/min；Trp紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；Kyn紫外檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2 結(jié)果

2.1 AA大鼠模型的建立模型組大鼠在免疫后第14天出現(xiàn)繼發(fā)病變，出現(xiàn)足爪紅腫，體質(zhì)量減輕，全身評(píng)分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和足爪腫脹度明顯增加，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1～6。

圖1 肉眼觀察大鼠足爪腫脹

2.2 HPLC方法學(xué)結(jié)果

2.2.1專屬性實(shí)驗(yàn) 在1.6項(xiàng)色譜條件下分別對(duì)空白血清、空白血清加對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)樣分析，Trp保留時(shí)間9.0 min，Kyn保留時(shí)間5.6 min，峰形良好，樣品中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，與雜質(zhì)分離良好。結(jié)果見(jiàn)圖7～9。

圖2 大鼠全身評(píng)分

圖3 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)

圖4 大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)

圖5 大鼠足爪腫脹度

2.2.2線性關(guān)系考察

2.2.2.1Trp標(biāo)準(zhǔn)曲線 取20 000 μmol/L Trp對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入空白血清中，使Trp濃度分別為25、50、100、250、500、1 000 μmol/L，并按1.5.4中供試品溶液處理后進(jìn)行HPLC分析。以加入對(duì)照品溶液樣品峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，Trp:Y=2.387 8X-6.893 5,R2=0.999 8, Trp在25～1 000 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。

2.2.2.2Kyn標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1 000 μmol/L Kyn對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入空白血清中，使Kyn濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 μmol/L，并按1.5.4中供試品溶液處理后進(jìn)行HPLC分析。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，Kyn:Y=2.753 8X-1.156 6,R2=0.999 3, Kyn在0.5～20 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表2。

圖6 大鼠體質(zhì)量變化

表1 Trp標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 空白血清Kyn和Trp色譜圖

編號(hào)123456濃度(μmol/L)0.51251020峰面積0.96±0.271.68±0.424.94±0.1512.80±0.7025.88±1.7154.20±2.33

圖8 空白血清外加對(duì)照品色譜圖

2.2.3檢測(cè)限和定量限 在血清中加入一定量的對(duì)照品溶液，按1.5.4項(xiàng)中樣品處理方法進(jìn)行HPLC分析并做3次平行實(shí)驗(yàn)。按信噪比(S/N)為3計(jì)檢測(cè)限，Trp、Kyn檢測(cè)限分別為0.27 μmol/L、0.07 μmol/L；按S/N為10計(jì)定量限，Trp、Kyn定量限分別為0.83 μmol/L、0.56 μmol/L。

2.2.4回收率(準(zhǔn)確度)試驗(yàn) 取Trp和Kyn對(duì)照品溶液加入到空白血清中制成低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，處理后進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)濃度1 d內(nèi)平行配制3個(gè)樣品，測(cè)定回收率，Trp回收率為96.71%～112.58%，Kyn回收率為92.60%～117.82%。見(jiàn)表3。

表3 Trp和 Kyn回收率

圖9 實(shí)際樣品Trp和Kyn色譜圖

活性物質(zhì)濃度(μmol/L)日內(nèi)精密度實(shí)際樣品濃度(μmol/L)RSD(%)日間精密度實(shí)際樣品濃度(μmol/L)RSD(%)Trp5054.13±2.684.9553.65±2.414.49250242.39±3.451.43244.57±4.021.65500812.96±29.763.67816.58±26.733.27Kyn11.090±0.0978.901.100±0.0837.5555.756±0.1462.545.690±0.1332.341012.009±0.2812.3411.893±0.3723.13

2.2.5精密度試驗(yàn) 取Trp和Kyn對(duì)照品溶液加入空白血清中制成低、中、高3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)血樣，每個(gè)濃度水平1 d內(nèi)平行配制3個(gè)樣品，測(cè)定日內(nèi)精密度，每個(gè)濃度水平3 d內(nèi)測(cè)定3次，計(jì)算日間精密度。Trp和Kyn相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%，符合樣品分析要求。見(jiàn)表4。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取Trp和Kyn對(duì)照品溶液加入血清中，供試品分別在4 ℃、25 ℃下放置。將供試品分別在0、4、8、12、16、20、24 h測(cè)定Trp和Kyn含量考察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在4 ℃和25 ℃均可穩(wěn)定放置24 h，穩(wěn)定性較好，符合生物樣品穩(wěn)定性測(cè)定的要求。

2.3 實(shí)際樣品中Trp和Kyn測(cè)定用上述建立的方法測(cè)定了正常組和模型組大鼠血清中Trp和Kyn濃度。經(jīng)分析，模型組和正常組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與正常組比較，Trp的濃度降低，Kyn的濃度升高，Kyn/Trp比值升高。見(jiàn)表5。

表5 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

與正常組比較：**P<0.01

3 討論

由于Kyn代謝與炎癥免疫之間有著密切的關(guān)系，Kyn已成為RA等多種疾病的參與者[9]。在正常機(jī)體中，Trp和Kyn維持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)體內(nèi)的Trp和Kyn含量變化時(shí)，機(jī)體會(huì)誘發(fā)各種疾病，例如自身免疫病或惡性腫瘤等[4,10]。吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine2,3- dioxygenase,IDO1) 是此代謝通路的限速酶之一，目前大多數(shù)的研究是采用測(cè)定Kyn和Trp比值來(lái)評(píng)價(jià)IDO1的活性[11]，定量測(cè)定體內(nèi)Trp和Kyn濃度為診斷相關(guān)疾病提供了重要的依據(jù)。

大鼠體內(nèi)的Trp和Kyn均為內(nèi)源性物質(zhì)，建立方法學(xué)時(shí)需采用不含待測(cè)物的空白血清，排除血清自身Trp和Kyn對(duì)定量測(cè)定的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用Krebs- Ringer磷酸鹽緩沖液進(jìn)行血清透析，可獲得不含或含極少量?jī)?nèi)源性物質(zhì)的空白血清樣本。為了更進(jìn)一步提高測(cè)定的準(zhǔn)確性，還采用了標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)Trp和Kyn進(jìn)行檢測(cè)[12]。用HPLC測(cè)定血清中Trp、Kyn時(shí)需去除血清中的蛋白，本實(shí)驗(yàn)采用高氯酸蛋白沉淀法，無(wú)需衍生化處理與梯度洗脫，并與之前文獻(xiàn)[13]報(bào)道相比保留時(shí)間縮短，節(jié)約時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相中乙腈的比例調(diào)到8%，相對(duì)于乙腈比例為3%或4%峰面積響應(yīng)值增大，保留時(shí)間縮短。流速太小，峰面積響應(yīng)值小，出峰時(shí)間較長(zhǎng)，但流速太大，柱壓較大，最終采用1.0 ml/min的流速。

隨著對(duì)Trp、Kyn及其他代謝產(chǎn)物的的深入研究發(fā)現(xiàn)，Kyn是此代謝通路上極為重要的中間代謝物，在多種疾病中有重要作用，與疾病發(fā)展密切相關(guān)[14]，檢測(cè)Trp和Kyn濃度變得極為重要。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，AA大鼠Trp和Kyn及其比值都有顯著變化，Trp濃度降低，Kyn濃度升高，Kyn/Trp升高，提示Trp- IDO1- Kyn代謝通路異常可能參與RA的發(fā)生發(fā)展。HPLC有準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，是現(xiàn)階段檢測(cè)Trp和Kyn含量的主要方法。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)實(shí)際應(yīng)用，只需將血清去除蛋白，無(wú)需柱前衍生化即可進(jìn)行測(cè)定，且專屬性、線性范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等方法學(xué)指標(biāo)均符合測(cè)定要求，適用于大鼠體內(nèi)Trp和Kyn含量測(cè)定。