劉 沙，周 毅，鄭琪雪，張王剛，李淋淋，姜 浩，尤思路

花生四烯酸乙醇胺(anandamide，AEA)通過激動(dòng)大麻素I型(cannabinoid receptor 1, CB1)和II型(cannabinoid receptor 2, CB2)受體起到較好的神經(jīng)保護(hù)活性[1]。但由于AEA消除較快，不能維持其較好作用[2]。因此，基于AEA化學(xué)結(jié)構(gòu)式，合成了其類似物脂肪酰氨基酸- N- 硬脂酰絲氨酸(N- stearoyl serine，NSS)。研究[3]表明，脂肪酰氨基酸能改善細(xì)胞損傷。提示NSS是潛在的神經(jīng)保護(hù)候選藥物，但是其在阿爾茨海默病中的活性不詳。同時(shí)脂肪酰氨基酸作為AEA類似物具有和AEA相似的生物活性。提示NSS對腦損傷的保護(hù)作用可能通過大麻素受體介導(dǎo)。該研究基于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠探討NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)異常及神經(jīng)保護(hù)活性的研究，為進(jìn)一步深入研究大麻素受體的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 健康雄性C57BL正常小鼠10只，轉(zhuǎn)基因小鼠120只，體質(zhì)量(30±1)g，清潔級(jí)，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(川)2015-196。APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠，體質(zhì)量(30±1)g，清潔級(jí)，南京君科生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(川)2015-196。

1.1.2 試劑NSS由實(shí)驗(yàn)室自主合成，純度經(jīng)HPLC分析為≥98%，于冰箱保存NSS母液(20 mg/ml)；Western blot所用試劑及抗體(美國cell signaling technology公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記抗鼠IgG(美國proteintech公司)；Aβ42和Aβ40ELISA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；AM251(美國Selleck生物科技有限公司)；AM630(上海sigma公司)；石杉?jí)A甲(四川辰馬生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ChemiDoc XRS系統(tǒng)(美國MD公司)；轉(zhuǎn)棒式疲勞儀、Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 所有動(dòng)物飼養(yǎng)于動(dòng)物房，每天光照時(shí)間12 h，溫度(25±2)℃，自由進(jìn)水進(jìn)食。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥2個(gè)月。實(shí)驗(yàn)共分為14組，每組8只：① control組：C57BL/6J野生型小鼠；② model組：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；③ 1、2、5 mg/kg NSS組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，共3組；④ 1、2、5 mg/kg NSS + AM251組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS和2 mg/kg AM251共同處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，共3組；⑤ 1、2、5 mg/kg NSS+AM630組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS和2 mg/kg AM630共同處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，共3組；⑥ AM251組：利用2 mg/kg AM251處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；⑦ AM630組：利用2 mg/kg AM630處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；⑧ Y組：陽性對照組：利用5 mg/kg石杉?jí)A甲處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2.2開場實(shí)驗(yàn)[4]將小鼠放于開場箱的中間使其自由活動(dòng)5 min，自動(dòng)攝像儀將記錄小鼠行跡的過程及在箱體中的運(yùn)動(dòng)總路程，以及小鼠在箱體角落，邊緣及中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

1.2.3疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)[5]使用疲勞轉(zhuǎn)棒儀每天對小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練3次，使小鼠在5 min內(nèi)基本能夠隨轉(zhuǎn)棒而做相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)，避免在轉(zhuǎn)棒上失去平衡而掉落。以30 r/min的速度迫使小鼠在棒上運(yùn)動(dòng)。記錄各組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間。

1.2.4水迷宮實(shí)驗(yàn)(morris water maze，MWM)[6]將水迷宮分為4個(gè)象限，一個(gè)有機(jī)玻璃平臺(tái)(10 cm×30 cm)放置于其中一個(gè)象限，隱沒于水面下1～2 cm。將小鼠從任意一個(gè)象限放入水中，自動(dòng)攝像儀將從小鼠入水時(shí)跟蹤小鼠的行跡，記錄小鼠行跡的過程及尋找水下平臺(tái)的時(shí)間。水迷宮實(shí)驗(yàn)主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。① 定位航行實(shí)驗(yàn)主要訓(xùn)練小鼠和測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)前1 d，將每只小鼠分別放入水中自由活動(dòng)60 s，以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)第1～14天，小鼠分別從4個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中若干次，利用水迷宮分析系統(tǒng)記錄其尋找到隱沒于水下平臺(tái)的時(shí)間。若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)至平臺(tái)上停留20 s。通過計(jì)算各組小鼠每天到達(dá)平臺(tái)的平均時(shí)間，評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。② 空間探索實(shí)驗(yàn)檢測小鼠訓(xùn)練后對平臺(tái)空間位置的記憶能力。此實(shí)驗(yàn)基于定位航行實(shí)驗(yàn)后去除平臺(tái)的水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，在定位航行實(shí)驗(yàn)第15天任選1個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水池中，記錄其在60 s內(nèi)的游泳軌跡，軟件自動(dòng)分析其在各象限所用的時(shí)間，考察小鼠記憶隱沒于水面下平臺(tái)的能力。

1.2.5ELISA實(shí)驗(yàn)檢測Aβ42及Aβ40的含量 用生理鹽水灌流清除血液后獲取小鼠腦組織樣品，剝離出海馬組織，加入中等強(qiáng)度的RIPA蛋白裂解液，4 ℃冰浴勻漿產(chǎn)物，12 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測樣品，用于Aβ42及Aβ40檢測，操作步驟參照Invitrogen試劑盒說明書。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn)檢測CB2的蛋白表達(dá)水平 收集各組海馬區(qū)域，RIPA裂解液于冰上裂解，離心后收集上清液即總蛋白，并加入5×SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸8 min；通過SDS- PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入一抗兔抗鼠CB2(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶4 000)，4 ℃過夜孵育；將膜洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG(1 ∶8 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后化學(xué)發(fā)光顯色，照相。應(yīng)用Tanon Gel pro凝膠成像系統(tǒng)軟件測定條帶灰度值。以GAPDH作為參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對含量，不同組別進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠自主活動(dòng)能力的影響model組小鼠相對于control組小鼠在開場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)總路程明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1；與model組比較，NSS組小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程無顯著性差異。同時(shí)，小鼠在開場中央、邊緣及角落等區(qū)域均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠自主活動(dòng)能力的影響

1:Control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05

2.2 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響隨著訓(xùn)練時(shí)間延長，小鼠停留于轉(zhuǎn)棒時(shí)間明顯延長。訓(xùn)練到第6天時(shí)，model組小鼠相對于control組小鼠停留于轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.533,P<0.05)，見圖2A；訓(xùn)練到第7天時(shí)，與model組比較，5 mg/kg NSS組和Y組能明顯提高轉(zhuǎn)基因小鼠停留于轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.587，P<0.05，P<0.01)，見圖2B；訓(xùn)練到第12天時(shí)，與model組比較，2 mg/kg NSS組能明顯提高轉(zhuǎn)基因小鼠停留于轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.902，P<0.05)，見圖2C，AM630能明顯逆轉(zhuǎn)NSS作用。

2.3 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，小鼠通過學(xué)習(xí)和記憶尋找水下平臺(tái)時(shí)間不斷縮短。訓(xùn)練到第6天時(shí)，與model組小鼠比較，5 mg/kg NSS組和Y組尋找水下平臺(tái)時(shí)間逐漸縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.904，P<0.05)，見圖3A，訓(xùn)練到第7天時(shí)，與model組小鼠比較，5 mg/kg給藥組和Y組的小鼠水下平臺(tái)的尋找時(shí)間進(jìn)一步縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.597，P<0.05，P<0.01)，見圖3B；訓(xùn)練到第11天時(shí)，與model組比較，2 mg/kg NSS組能明顯縮短轉(zhuǎn)基因小鼠尋找水下平臺(tái)的時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.445，P<0.05)，見圖3D，AM630能明顯逆轉(zhuǎn)NSS作用。

訓(xùn)練到第14天后，撤除水下平臺(tái)進(jìn)行探索性實(shí)驗(yàn)。與model組比較，NSS組(2 mg/kg，5 mg/kg)和Y組小鼠在第Ⅲ象限中停留時(shí)間明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.721，P<0.05，P<0.01，P<0.001)，見圖3C。AM630能逆轉(zhuǎn)NSS作用。

2.4 NSS降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ水平如圖4所示：與control組比較，model組的腦部海馬組織中Aβ42及Aβ40的含量顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(Aβ42)=10.727,F(Aβ40)=8.229，P<0.01，P<0.001)。與model組比較，NSS組能顯著降低Aβ42及Aβ40的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。加入CB2受體拮抗劑AM630能逆轉(zhuǎn)NSS作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響

A：第6天疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)；B：第7天疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)；C：第8～14天疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)；1:control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS 2 mg/kg組比較：#P<0.05；與NSS 5 mg/kg組比較：▽P<0.05

圖3 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

A：第6天定位航行實(shí)驗(yàn);B：第7天定位航行實(shí)驗(yàn)；C：空間探索實(shí)驗(yàn)；D：第8～14天定位航行實(shí)驗(yàn);1:control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS 2 mg/kg+AM630組比較:#P<0.05；與NSS 5 mg/kg+AM630組比較:▽P<0.05

圖4 NSS和AM630對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦部海馬組織中Aβ40及Aβ42含量的影響

1：control組；2：model組；3：NSS組；4：NSS+AM630組；5：AM630；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS組比較：#P<0.05

2.5 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中CB2蛋白表達(dá)的影響與control組比較，model組海馬組織中CB2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，NSS能逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 NSS對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦部海馬組織中CB2蛋白表達(dá)的影響

1：control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

APP轉(zhuǎn)基因小鼠最早用于AD模型小鼠，主要模擬腦內(nèi)Aβ斑塊形成過程，PS轉(zhuǎn)基因小鼠使用較少，其常作為一種條件致病基因，協(xié)助其他相關(guān)基因的表達(dá)，使得模型小鼠病理改變更加明顯，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是最能模擬人AD腦內(nèi)區(qū)域性與特異性的病理改變[7]。

本實(shí)驗(yàn)首先從整體動(dòng)物水平對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，選用石杉?jí)A甲作為陽性對照組，原因?yàn)槠淇捎糜诟餍桶V呆、記憶認(rèn)知功能及情緒行為障礙[8]。從動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NSS能改善小鼠行為學(xué)異常現(xiàn)象，2 mg/kg和5 mg/kg有顯著性差異，1 mg/kg無此作用。提示NSS的作用存在于一定劑量范圍內(nèi)，劑量偏低可能影響其對腦組織的保護(hù)作用。在開場實(shí)驗(yàn)中，NSS對轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程以及在角落、邊緣及中央?yún)^(qū)域的運(yùn)動(dòng)時(shí)間都無影響，表明NSS對小鼠的自主活動(dòng)并無影響。在疲勞轉(zhuǎn)棒儀和水迷宮實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，NSS能提高轉(zhuǎn)基因小鼠的活動(dòng)能力，表明小鼠的精神活動(dòng)表現(xiàn)良好，協(xié)調(diào)及抗疲勞能力增強(qiáng)，并能增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶能力，提示NSS提高小鼠在轉(zhuǎn)棒上的協(xié)調(diào)能力，有可能與其學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)有關(guān)。CB2受體抑制劑AM630逆轉(zhuǎn)NSS的作用，而AM251無此作用，表明NSS通過CB2受體改善轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)異常，CB1受體并未參與到NSS的作用中。

老年斑是AD的主要病理改變之一，Aβ1- 42是構(gòu)成老年斑重要的組成部分[9]。本研究顯示NSS降低轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ42及Aβ40的水平，AM630能逆轉(zhuǎn)NSS的作用，提示NSS通過CB2受體調(diào)控Aβ42及Aβ40水平，與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)趨勢一致。

CB2受體參與多條生理病理進(jìn)程，表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護(hù)活性[10]。研究發(fā)現(xiàn)NSS在低、中、高劑量均能上調(diào)CB2受體的表達(dá)，表明NSS可能通過CB2受體改善小鼠行為學(xué)異常及降低Aβ40和Aβ42的水平。在動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，NSS在低劑量組無作用，而NSS在低劑量時(shí)能上調(diào)CB2受體，可能因?yàn)閭€(gè)體的差異性引起低劑量組行為學(xué)不穩(wěn)定，低劑量的NSS不足以改善行為學(xué)異常，同時(shí)也表明NSS在不同劑量下顯示不同的藥理效應(yīng)。NSS是否直接激動(dòng)CB2受體需要后期進(jìn)一步研究。

本研究顯示，NSS能明顯改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及抗疲勞能力，同時(shí)降低Aβ42和Aβ40的水平，此過程可能依賴于CB2受體。