朱 寧，束 軍，張 梅，沈繼龍

能量代謝失衡是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，許多腫瘤細(xì)胞在氧供應(yīng)充足條件下，仍然優(yōu)先選擇糖酵解而不是氧化磷酸化，即有氧糖酵解[1]，這就是著名的瓦博格效應(yīng)(Warburg effect)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與腫瘤的糖酵解關(guān)系密切，研究[2-4]表明，抑制異常糖酵解可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲。乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)是糖酵解途徑中最后一個(gè)酶，其同工酶乳酸脫氫酶A(lactic dehydrogenase A，LDHA)在包括非小細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高表達(dá)[4-5]。Galloflavin(GF)是特異性LDH抑制劑。近年來(lái)一些研究[6-7]表明，GF可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，然而GF與肺腺癌細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道，該研究旨在觀察不同濃度GF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器人肺腺癌A549細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院惠贈(zèng)；GF、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK- 8試劑盒、胰酶、胎牛血清購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI- 1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司(美國(guó))；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，乳酸脫氫酶試劑盒、乳酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2CCK- 8法檢測(cè)不同濃度的GF對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104個(gè)/ml鋪96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μl細(xì)胞懸液，放在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組各孔加入不同濃度的GF(12.5、25、50、100 μmol/L)，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。作用24、48 h后，各孔加入CCK- 8試劑10 μl，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(optical density，OD)值。計(jì)算不同濃度的GF對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率(%)=[1-實(shí)驗(yàn)組OD值]/對(duì)照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3不同濃度的GF對(duì)A549細(xì)胞體外遷移能力的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞接種于6孔板，接種前先用marker筆在6孔板背面，用直尺比著，均勻劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1 cm一道橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿時(shí)用200 μl無(wú)菌槍頭垂直于6孔板背面的橫線劃痕。棄原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，去除劃下的細(xì)胞，加無(wú)血清的培養(yǎng)基，使用顯微鏡拍照，為0 h的劃痕寬度，棄原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度GF(25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，24 h后使用倒置顯微鏡在相同位置觀察拍照，隨后用Image- pro plus 6.0軟件計(jì)算遷移距離，遷移距離=0 h距離-24 h距離。

1.2.4Transwell法檢測(cè)GF對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響 Martigel膠4 ℃過夜融化后，用4 ℃預(yù)冷的無(wú)血清1640培養(yǎng)基將Martigel膠按1 ∶8比例稀釋。在Transwell上室底部均勻加入50 μl稀釋后的Martigel膠，鋪滿小室底部，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱干燥30 min，待Martigel膠凝固后，小心棄去上層析出的液態(tài)培養(yǎng)基，每個(gè)小室再加入50 μl無(wú)血清1640培養(yǎng)基，放于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min水化基底膜。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度GF(25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，作用24 h。常規(guī)消化，用PBS和無(wú)血清1640培養(yǎng)基先后洗滌1次，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整各組A549細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，在下室加入含10%胎牛血清1640完全培養(yǎng)基600 μl，上室加入100 μl細(xì)胞懸液，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)24 h。棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干后用1%結(jié)晶紫染色液染色約30 min，用濕棉棒小心擦去上室底部膜上表面上的細(xì)胞。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡(×100)觀察拍照，200倍高倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)，即侵襲細(xì)胞數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5乳酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GF對(duì)乳酸脫氫酶活性的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞接種于6孔板(2×105個(gè)/ml)，細(xì)胞貼壁融合60%～70%后，以不同濃度的GF(0、25、50、100 μmol/L )干預(yù)細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞裂解液提取蛋白，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明加樣，酶標(biāo)儀562 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本蛋白濃度。按酶活性試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定LDH活性。

1.2.6乳酸定量試劑盒檢測(cè)GF對(duì)乳酸生成量的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，按照每孔4 000個(gè)接種于96孔板，以不同濃度的GF(0、25、50、100 μmol/L )干預(yù)細(xì)胞，24 h后，按照試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定乳酸生成量。

2 結(jié)果

2.1 GF抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖CCK- 8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的GF分別干預(yù)A549細(xì)胞24、48 h，其OD值及抑制率見表1。各濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在相同作用時(shí)間情況下，GF對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率隨著GF濃度的增加而增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且在相同濃度GF作用下，A549細(xì)胞在48 h的增殖抑制率明顯高于24 h的增殖抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24 h時(shí)F=144.0，P<0.05；48 h時(shí)F=363.9，P<0.05。綜上，GF對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。

表1 不同濃度的GF分別干預(yù)細(xì)胞24、48 h對(duì)其增殖的影響

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與12.5 μmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與25 μmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：▽P<0.05；與50 μmol/L實(shí)驗(yàn)組比較：△P<0.05；與24 h比較：▼P<0.05

圖1 GF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響×100 A：對(duì)照組；B～D：GF 25、50、100 μmol/L；1：0 h；2：24 h；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與25 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與50 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：△P<0.05

2.2 GF抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的遷移對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為(70.79±2.89)μm，實(shí)驗(yàn)組(25、50、100 μmol/L)遷移距離分別為(45.24±3.46)、(32.64±0.96)、(21.75±1.90)μm；與對(duì)照組比較，不同濃度梯度的GF干預(yù)組遷移距離均明顯減小，且隨著GF濃度的增加，遷移距離逐漸減少，各干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=221.4，P<0.05)，見圖1。

2.3 GF抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為(196.67±3.06)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組(25、50、100 μmol/L)侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(151.33±4.16)、(116.33±5.69)、(75.33±5.03)個(gè)，與對(duì)照組比較，不同濃度梯度的GF干預(yù)組細(xì)胞侵襲數(shù)均明顯減少，且隨著GF濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=378.4，P<0.05)，見圖2。

A：對(duì)照組；B～D：GF 25、50、100 μmol/L；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與25 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與50 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：△P<0.05

2.4 GF抑制LDH活性不同濃度梯度的GF(0、25、50、100 μmol/L)干預(yù)細(xì)胞24 h后，隨著GF濃度的增高，LDH活性逐漸降低，不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.9，P<0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度GF對(duì)A549細(xì)胞LDH活性的影響

與對(duì)照組(0 μmol/LGF)比較：*P<0.05；與25 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：#P<0.05；與50 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：△P<0.05

2.5 GF抑制乳酸生成不同濃度梯度GF(0、25、50、100 μmol/L)干預(yù)細(xì)胞24 h后，隨著GF濃度的增加，乳酸生成量逐漸減少，不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.78，P<0.05)。見圖4。

圖4 不同濃度GF對(duì)A549細(xì)胞乳酸生成量的影響

與對(duì)照組(0 μmol/L)比較：*P<0.05；與25 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：△P<0.05；與50 μmol/LGF實(shí)驗(yàn)組比較：▲P<0.05

3 討論

目前肺癌在世界范圍內(nèi)已成發(fā)病率及死亡率均居前列的惡性腫瘤，5年生存率只有18%[8]。非小細(xì)胞肺癌(non- small lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%，是肺癌最常見的病理類型。雖然手術(shù)、化療、放療等治療手段不斷進(jìn)步，但其預(yù)后并未得到明顯改善[9]。近年來(lái)，NSCLC的分子靶向治療取得了巨大的突破，已成為NSCLC治療的先進(jìn)手段，但靶向治療也面臨著細(xì)胞耐藥等許多問題[10]。因此，尋找新的靶向抗肺癌藥物勢(shì)在必行。

線粒體能量代謝異常是腫瘤細(xì)胞顯著的生物學(xué)特征之一。LDH是糖酵解途徑中的最后一個(gè)標(biāo)志酶，它催化丙酮酸還原為乳酸。在人類細(xì)胞中存在5種LDH亞型，其中LDHA與腫瘤關(guān)系密切，LDHA在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤遷移及侵襲[4-5,11]，高表達(dá)的LDHA與腫瘤患者的放化療抵抗及不良預(yù)后呈相關(guān)性。Yang et al[12]研究表明，經(jīng)典的LDHA抑制劑草氨酸鹽(oxamate)可以抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，但只有在高濃度時(shí)才能發(fā)揮抑制作用。

GF即沒食子酸衍生物，為特異性LDH抑制劑，可以通過與游離的LDH結(jié)合發(fā)揮作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)低濃度的GF可通過阻斷糖酵解途徑抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[6]、乳腺癌細(xì)胞[7]的增殖，但GF應(yīng)用于治療肺癌尚未見相關(guān)研究。本研究旨在探索不同濃度的GF對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用的影響及可能機(jī)制。本研究結(jié)果表明，GF可以抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并且隨著GF濃度的增加，抑制作用越明顯。

為了進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制，對(duì)LDH活性及乳酸生成量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著GF濃度增加，LDH活性及乳酸生成量均逐漸減少。說(shuō)明GF可以通過阻斷糖酵解途徑從而抑制A549細(xì)胞增殖。近年的研究[14-15]顯示，乳酸可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，敲除糖酵解途徑中的LDH可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移。本研究同樣發(fā)現(xiàn)GF可以通過抑制LDH的活性來(lái)減少乳酸生成，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲，且LDH活性越低，其遷移侵襲抑制作用越強(qiáng)。由于正常細(xì)胞主要利用氧化磷酸化獲取能量，抑制LDH活性對(duì)正常細(xì)胞影響不大，F(xiàn)arabegoli et al[7]研究發(fā)現(xiàn)GF對(duì)于人類正常的淋巴細(xì)胞影響不明顯，提示靶向針對(duì)糖酵解途徑可以在不影響正常細(xì)胞的情況下抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，本研究表明GF作為L(zhǎng)DH抑制劑，可能通過抑制糖酵解途徑中LDH的活性抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。但是本實(shí)驗(yàn)只涉及離體的肺癌細(xì)胞系，GF在體內(nèi)抗肺癌作用及其穩(wěn)定性和安全性仍需進(jìn)一步研究。