張奇龍，薛 威，徐博涵，唐 虹，江 勤，董六一

腦卒中是一類(lèi)復(fù)雜的高發(fā)病，發(fā)病后其病死率、致殘率及復(fù)發(fā)率均高，目前已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的三大疾病之一。其中缺血性卒中約占腦卒中疾病總數(shù)的70%，是由于大腦血供障礙而引發(fā)的缺血、缺氧，導(dǎo)致局限性腦缺血性壞死的一種疾病[1]。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glycoside, TSG)是從中藥何首烏中提取的有效成分，國(guó)內(nèi)外研究[2]表明TSG具有抗氧化、抗補(bǔ)體、擴(kuò)張血管、抑制Ca2+- ATP酶活性等保護(hù)作用，但是TSG對(duì)腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)的作用機(jī)制尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立小鼠急性腦缺血再灌注模型，研究TSG對(duì)小鼠急性CIRI引起的氧化應(yīng)激及自噬的影響，初步探討TSG對(duì)抗CIRI的可能機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量22～24 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(皖)2011- 002，飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中進(jìn)行，溫度范圍(22±3)℃，濕度范圍：40%～70%，照明周期：12 h明/12 h暗，自由攝水進(jìn)食。

1.2 藥品與試劑TSG購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；自噬相關(guān)基因Beclin1抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule- associated protein 1 light chain 3, LC3)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔、鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；蘇木精-伊紅染料購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司；多聚甲醛溶液購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；二甲苯購(gòu)自四川綠森林化工有限公司；水合氯醛購(gòu)自合肥國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio- Rad公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；立式夾心電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio- rad公司；DYY 8C型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)LECIA公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分成5組，分別為：假手術(shù)組、模型組、TSG低劑量組(3 mg/kg)、TSG中劑量組(6 mg/kg)、TSG高劑量組(12 mg/kg)，每組20只，其中10只小鼠用于腦組織含水量檢測(cè)，另外10只小鼠用于腦組織病理學(xué)檢測(cè)和免疫印跡蛋白檢測(cè)。

1.4.2小鼠急性CIRI模型建立 所有小鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，進(jìn)行手術(shù)造模。參照Wang et al[3]的方法略加改進(jìn)，10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，備皮，頸部皮膚切開(kāi)約1.0 cm，鈍性分離皮下組織，暴露出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，下穿以6- 0號(hào)手術(shù)縫合線(xiàn)，結(jié)扎2 h而后松開(kāi)絲線(xiàn)進(jìn)行再灌24 h 。在缺血2 h和再灌注24 h內(nèi)用電熱毯維持小鼠肛溫在(36.5～37.5) ℃ 。假手術(shù)組僅做雙側(cè)頸總動(dòng)脈分離，不做結(jié)扎處理。TSG于缺血和再灌注前尾靜脈注射給藥各1次，給藥容積為0.1 ml/10 g，假手術(shù)組和模型組僅給予等量的生理鹽水。

1.4.3腦組織含水量檢測(cè) 造模后小鼠快速斷頭取出大腦，去除小腦和腦干，用濾紙吸干表面液體。用電子天平稱(chēng)取標(biāo)本的濕重，然后將腦組織置入電熱恒溫烘箱(110±2) ℃中烘24 h至恒重，稱(chēng)取干重。采用干、濕比重法，計(jì)算腦組織含水量。公式如下：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.4病理組織學(xué)檢查 小鼠腦缺血再灌注后處死取腦，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋制成切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，正置顯微鏡下觀察小鼠腦組織病理變化。

1.4.5血清SOD活性與MDA含量檢測(cè) 各組小鼠造模后摘除眼球采血，室溫靜置30 min后放入提前預(yù)冷好的4 ℃離心機(jī)，4 000 r/min離心10 min后取上清液，即為血清，迅速放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清SOD活性及MDA含量。

1.4.6蛋白印跡法檢測(cè)自噬蛋白表達(dá)水平 將腦組織于冰上反復(fù)研磨制備腦組織勻漿；加入適量RIPA裂解液, 4 ℃離心后取上清液,BCA試劑盒測(cè)總蛋白濃度。以10～50 μg總蛋白上樣, 12%SDS- PAGE凝膠電泳, 電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)牛奶封閉、TBST漂洗后, 分別加入Beclin1及LC3一抗(1 ∶1 000), 在4 ℃冰箱放置過(guò)夜后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000) ，TBST洗膜， 發(fā)光顯影，曝光拍照。采用Image J圖像處理軟件分析采集的圖像, 以Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ與β- actin蛋白條帶灰度的比值來(lái)表示Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSG對(duì)CIRI小鼠腦含水量的影響與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織含水量顯著增加(F=2.55，P<0.01)。與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著抑制小鼠腦組織含水量的增加(P<0.05，P<0.05)，有效改善腦組織水腫程度，見(jiàn)表1。

表1 TSG對(duì)CIRI小鼠腦含水量的影響

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.2 TSG對(duì)CIRI小鼠腦組織病理學(xué)變化的影響HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)正常，排列整齊，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，毛細(xì)血管和小血管管腔較窄或呈實(shí)性條索，未見(jiàn)腦神經(jīng)元損傷等病理性改變；模型組小鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性、壞死，中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，間質(zhì)細(xì)胞水腫疏松呈網(wǎng)狀，神經(jīng)細(xì)胞、毛細(xì)血管和小血管周?chē)拈g隙增寬，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，其胞質(zhì)透亮區(qū)加大。TSG高、中劑量治療組小鼠腦皮層神經(jīng)元的病理性損傷較輕，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增加，并可改善神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，減輕核固縮，見(jiàn)圖1。

圖1 TSG對(duì)小鼠腦CIRI后皮層腦組織病理學(xué)損傷的影響HE×200 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TSG高劑量組；D：TSG中劑量組；E：TSG低劑量組

2.3 TSG對(duì)CIRI小鼠血清中SOD、MDA含量的影響與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)物血清中SOD活性明顯降低(F=3.71，P<0.05)，與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著升高小鼠血清中SOD活性(P<0.01，P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物血清中MDA含量明顯增高(F=5.14，P<0.01)，與模型組比較，TSG高、中劑量組可顯著降低小鼠血清中MDA的含量(P<0.05，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 TSG對(duì)CIRI小鼠血清中SOD、MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 TSG對(duì)小鼠CIRI誘導(dǎo)的自噬蛋白Beclin1表達(dá)的影響蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組Beclin- 1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.83，P<0.05)。TSG高劑量組可顯著抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的Beclin- 1上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 TSG對(duì)CIRI后Beclin1蛋白表達(dá)的影響

1：假手術(shù)組； 2：模型組； 3： TSG高劑量組；4：TSG中劑量組；5：TSG低劑量組;與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 TSG對(duì)小鼠CIRI誘導(dǎo)的自噬蛋白LC3- Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的影響蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠缺血再灌注24 h后，模型組中LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(F=12.17，P<0.05)。與模型組比較，TSG高劑量組可明顯抑制LC3- Ⅱ/Ⅰ的相對(duì)表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 TSG對(duì)CIRI后LC3- Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

1：假手術(shù)組； 2：模型組；3：TSG高劑量組；4：TSG中劑量組；5：TSG低劑量組;與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

TSG是傳統(tǒng)中藥何首烏的主要有效成分之一，具有抗機(jī)體氧化、提高免疫力、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎抗腫瘤等作用，有“益血?dú)?、益精髓、黑鬢發(fā)、延年不老”的功效[4]。既往研究[5]顯示，何首烏及其活性成分可以減輕腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，但對(duì)缺血性腦損傷的藥理活性及機(jī)制尚未有效闡明。

細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累，活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇脂質(zhì)過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷[6]。SOD、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)等都是防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。在腦缺血再灌注時(shí)過(guò)氧化物大量產(chǎn)生，抗氧化系統(tǒng)的過(guò)度消耗又不能得到及時(shí)的補(bǔ)充，導(dǎo)致體內(nèi)SOD、GSH活性降低，同時(shí)因脂質(zhì)過(guò)氧化使MDA的生成量升高，造成嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)功能損害。本研究結(jié)果顯示，小鼠急性CIRI后血清中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加， TSG高、中劑量組(12、6 mg/kg)均能顯著升高小鼠血清中SOD活性，降低MDA的含量，提示TSG能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)減輕繼發(fā)性腦損傷具有重要作用，與其他學(xué)者的發(fā)現(xiàn)一致[7]。

CIRI的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基異常增多、興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用、微循環(huán)障礙和多種炎性細(xì)胞因子釋放等[8-9]。當(dāng)缺血再灌注損傷發(fā)生后，可以出現(xiàn)壞死性細(xì)胞死亡和凋亡性細(xì)胞死亡，但近年來(lái)自噬逐漸被認(rèn)為是除細(xì)胞壞死和凋亡外的第 3 種死亡方式[10]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明[11]，氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生并且應(yīng)用抗氧化劑能抑制自噬并減少細(xì)胞死亡。神經(jīng)元損傷的嚴(yán)重程度直接關(guān)系到自噬在腦缺血性損傷中的作用。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過(guò)降解蛋白提供能量，而且能夠通過(guò)降解損傷的蛋白后合成新的蛋白，從而保護(hù)著機(jī)體的細(xì)胞。若重度缺血、缺氧或延長(zhǎng)細(xì)胞損傷的時(shí)間激活相關(guān)調(diào)控蛋白后，自噬也過(guò)度激活，過(guò)度激活的自噬又進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞損傷的發(fā)生，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷作用[12-13]。腦缺血時(shí)腦組織血流不足，腦細(xì)胞代謝障礙，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞嚴(yán)重不可逆性損傷和死亡。本研究顯示CIRI后腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性壞死且排列紊亂無(wú)層次感，模型組的自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增加，提示缺血再灌注損傷后神經(jīng)元損傷明顯增加，自噬水平明顯提高，而用TSG干預(yù)后腦皮層的病理?yè)p傷得以減輕，且與模型組相比自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3- Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著降低，提示TSG能夠抑制缺血后的過(guò)度自噬，保護(hù)缺血神經(jīng)元損傷，但TSG對(duì)通過(guò)何種途徑抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。