李秀義，高冬梅，張守柱，潘繼文，溫 和

風(fēng)疹病毒(rubella virus，RV) 的主要危害在于孕早期(前3個月)感染可導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重的出生缺陷，即先天性風(fēng)疹綜合征(congenital rubella syndromes，CRS)[1-3]。RV有3個結(jié)構(gòu)蛋白C、E2和E1，其中E1是主要的膜蛋白，為免疫顯性[4-5]。Bosma et al[6]和Starkey et al[7]研究發(fā)現(xiàn)，E1蛋白上195～296aa區(qū)域是E1蛋白的主要抗原區(qū)域，其相應(yīng)氨基酸序列高度保守，提示E1蛋白的此特異片段可作為特異診斷抗原用于RV抗體檢測。目前血清學(xué)特異性抗體檢測是我國孕婦產(chǎn)前致畸因子篩查的主要手段，新發(fā)RV感染的血清學(xué)診斷主要依賴于RV- IgM抗體的檢測[8]。課題通過生物信息學(xué)預(yù)測獲得E1蛋白優(yōu)勢抗原表位序列進行全基因合成，在畢赤酵母中表達，為研發(fā)特異性強和靈敏度高的國產(chǎn)RV- IgM抗體ELISA試劑盒提供基礎(chǔ)，以改善試劑長期依賴進口的局面。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pGAPZαA、E.coliXL1- blue、畢赤酵母KM17和JM109由合肥市第一人民醫(yī)院檢驗科免疫室留存。

1.1.2血清 100份由合肥市CDC提供的經(jīng)酶聯(lián)免疫捕獲法(珠海海泰制藥有限公司)檢測IgM可疑陽性血清，300份合肥市第一人民醫(yī)院正常體檢經(jīng)檢測(同上)IgM陰性血清。

1.1.3實驗試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、T4DNA連接酶、PCR Marker、Taq DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑和瓊脂糖凝膠電泳DNA純化回收試劑均購自北京道普生物科技有限公司；化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購自美國Pierce公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1全基因合成 由Pubmed的Nucleotide數(shù)據(jù)庫得到風(fēng)疹病毒編碼結(jié)構(gòu)蛋白C、E2、E1的24s mRNA亞基因組序列共3 382 bp(GenBank:X05259.1)，編碼的蛋白質(zhì)為992 aa。其中編碼E1蛋白序列為氨基酸581～992 aa(共412 aa)。本實驗擬研究E1蛋白主要抗原區(qū)域195～296 aa。據(jù)此設(shè)計目的片段(2 464～2 769 bp，共306 bp)的DNA序列，同時考慮與質(zhì)粒pGAPZα重組時必須有DNA序列的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶，在設(shè)計目的片段DNA序列時在兩條鏈上分別加上內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ的酶切位點(pGAPZα亦含此兩酶的酶切位點)，因此設(shè)計DNA序列為：正鏈：5′-CTAGACAGGTCCCGCCCGACCCTGGGGACCTGGTCGAGTACATTAT- GAATTACACCGGCAACCAACAGTCCCGGTGGGGC- CTCGGGAGCCCGAATTGTCATGGCCCCGATTGGGC- CTCCCCGGTTTGCCAACGCCACTCCCCTGACTGCTC- GCGGCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGC- TGCGCCTGGTCGACGCCGATGACCCCCTGCTGCGC- ACTGCCCCCGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCC- TGTCATAGGCTCTCAGGCGCGCAAGTGCGGACTCC- ACATACGTGCTGGACCGTACG- 3′(下劃線標(biāo)注為XbaⅠ酶切位點)；負鏈5′-AATTCGTACGGTCCAGCACGTATGTGGAGTCCGCACTTGCGCGCCTGAGAG- CCTATGACAGGCGTGACCCACACCTCGCCGGGCCC- GGGGGCAGTGCGCAGCAGGGGGTCATCGGCGTCG- ACCAGGCGCAGCCGGGGACGCTCTGGCGTGGCCC- CCACAAGCCGCGAGCAGTCAGGGGAGTGGCGTTG- GCAAACCGGGGAGGCCCAATCGGGGCCATGACAA- TTCGGGCTCCCGAGGCCCCACCGGGACTGTTGGTT- GCCGGTGTAATTCATAATGTACTCGACCAGGTCCC- CAGGGTCGGGCGGGACCTGT- 3′(下劃線標(biāo)注為EcoRⅠ酶切位點)。將以上設(shè)計的兩條DNA單鏈送上海生物工程有限公司合成。

1.2.2pGAPZαA- E1特異片段的重組 將合成的兩條DNA單鏈經(jīng)變性、退火，生成DNA雙鏈，以內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ將質(zhì)粒pGAPZαA進行雙酶切；通過T4 DNA連接酶將目的DNA序列和線性化的pGAPZαA載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.2.3pGAPZαA- E1轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109及鑒定 采用氯化鈣法制備感受態(tài)大腸桿菌JM109，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌中，取少量涂于含抗生素Zeocin(質(zhì)粒pGAPZαA含編碼Zeocin的基因，可作為重組是否成功的選擇標(biāo)記)的LB瓊脂平板皿上，干燥后，倒置，存放于37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜，次日，觀察是否出現(xiàn)菌落。挑選單一菌落，在含抗生素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)擴增，之后提取質(zhì)粒DNA，以內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切重組質(zhì)粒進行鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒，進行DNA測序分析。

1.2.4將重組質(zhì)粒pGAPZαA- E1轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 提取重組成功的質(zhì)粒并用AvrⅡ線性化，純化線性化后的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM17細胞中，之后涂布于含抗生素Zeocin的固態(tài)培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)，至單菌落出現(xiàn)。

1.2.5重組酵母的鑒定、目的蛋白的表達、純化及鑒定

1.2.5.1重組酵母的鑒定、目的蛋白的表達、純化 挑取重組陽性的菌落發(fā)酵，收集上清液經(jīng)SDS- PAGE分析，觀察是否在11 ku處(根據(jù)氨基酸序列，以軟件預(yù)測蛋白的分子量為11 ku)出現(xiàn)目的蛋白的表達，利用Ni2+- NTA樹脂柱對表達的重組蛋白進行純化并鑒定。

1.2.5.2Western blot檢測重組蛋白的抗原性 純化的重組E1蛋白常規(guī)進行SDS- PAGE。用半干濕法將凝膠上蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜，加封閉液室溫封閉2 h，PBS洗膜后，分別加急性RV感染者混合血清(1 ∶800稀釋)與正常人混合血清(1 ∶800稀釋)室溫作用1 h，然后再用PBS洗膜，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫作用1 h，PBS振洗后，最后通過化學(xué)發(fā)光法(按試劑使用手冊)檢測抗原抗體反應(yīng)。

1.2.6以重組蛋白作為包被抗原建立ELISA檢測方法

1.2.6.1確定重組抗原包被濃度、血清稀釋度 將重組蛋白抗原用包被液依次稀釋為 1 ∶1(10 μg/ml)、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32，每個稀釋度6孔，將陽性血清和陰性血清用包被液依次稀釋為1 ∶1、1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400，每個稀釋度設(shè)復(fù)孔，實驗步驟為：包被-封閉-加入血清-加入HRP- 鼠抗人μ鏈單克隆抗體-加底物-加入終止液，同時設(shè)置空白對照孔，測量A450/630的值。以重組RV蛋白抗原包被稀釋度為橫坐標(biāo)，陽性血清和陰性血清與空白對照A450/630的差值之比P/N=(待測樣品A450/630值-空白對照A450/630值)/(陰性對照A450/630值-空白對照A450/630值)×100%為縱坐標(biāo)作圖，選取P/N值最大時重組RV蛋白抗原的濃度為包被稀釋度，陰性血清A450/630值開始緩慢下降時的稀釋度為待測血清稀釋度。

1.2.6.2HRP- 鼠抗人μ鏈單克隆抗體工作濃度的確定 將30份急性RV感染者混合血清(陽性血清)及30份正常人混合血清(陰性血清)進行預(yù)實驗，然后將HRP- 鼠抗人μ鏈單克隆抗體倍比稀釋1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000，在確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的情況下，測量其A450/630的值，陽性值在1.0左右、陰性值在0.2左右時的HRP- 鼠抗人μ鏈單克隆抗體稀釋度為其工作濃度。

1.2.6.4重組目的蛋白診斷RV的靈敏性、特異性和符合率 利用意大利索林公司的化學(xué)發(fā)光定量試劑檢測前述的100份待測血清進行確認，然后利用合肥市第一人民醫(yī)院檢驗科免疫室初步建立的重組RV蛋白抗原 ELISA試劑和一種國產(chǎn)ELISA試劑同時檢測(操作按說明書進行)上述血清。計算不同試劑的檢測結(jié)果，并以索林化學(xué)發(fā)光定量試劑為金標(biāo)準(zhǔn)，計算并比較不同試劑之間的靈敏度和特異性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 17.0軟件進行分析。計數(shù)資料及等級資料的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGAPZαA- E1重組質(zhì)粒酶切及表達鑒定結(jié)果重組pGAPZαA- E1經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)一條大小與E1擴增條帶遷移率相同的電泳帶，其酶切圖譜與預(yù)期一致，利用通用引物對重組質(zhì)粒進行測序分析，結(jié)果與所合成的序列完全一致，見圖1A。純化的重組E1蛋白經(jīng)12%SDS- PAGE凝膠電泳檢測，約11 ku處見明顯的特異性單一條帶，與預(yù)期一致。見圖1B。

2.2 SjE1蛋白質(zhì)免疫印跡分析純化蛋白能夠被急性RV感染者混合血清識別而不被正常人血清識別，見圖2。

2.3 重組RV蛋白最適包被液濃度、待測血清與酶標(biāo)二抗的稀釋度當(dāng)隨著重組RV蛋白抗原濃度減少和血清稀釋度的增大，血清的A450/630值不斷減少，當(dāng)重組RV蛋白抗原包被稀釋度為1 ∶16(濃度為0.625 μg/ml)，血清稀釋倍數(shù)為1 ∶100時，陽性血清的A450/630值在1.0左右，且陰性值低，P/N值高，據(jù)此確定重組RV蛋白抗原包被液的濃度為0.625 μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1 ∶100。HRP- 鼠抗人μ鏈單克隆抗體的稀釋度仍為1 ∶2 000。

圖1 pGAPZαA- E1重組質(zhì)粒酶切及表達鑒定結(jié)果

A：pGAPZαA- E1重組質(zhì)粒酶切核酸電泳圖；1：重組pGAPZαA- E1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ酶切結(jié)果；2：重組pGAPZαA- E1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ酶切結(jié)果；3：pGAPZαA- E1被EcoRⅠ酶切結(jié)果；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品；B：重組E1蛋白電泳圖；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；4：純化蛋白

圖2 重組E1蛋白質(zhì)免疫印跡分析

2.5 重組目的蛋白診斷RV的靈敏性和特異性以索林公司的化學(xué)發(fā)光定量分析為金標(biāo)準(zhǔn)，自制重組RV蛋白抗原ELISA試劑與某種國產(chǎn)試劑的敏感性和特異性結(jié)果分別為95.29%、94.33%和88.24%、80.00%，重組RV蛋白抗原ELISA試劑明顯優(yōu)于某種國產(chǎn)試劑(表1、2)。經(jīng)χ2檢驗，重組RV蛋白抗原ELISA試劑與某種國產(chǎn)試劑比較，靈敏度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.08，P=0.146)，特異性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.50，P=0.500)。見表3。

表1 自建重組RV蛋白抗原ELISA試劑盒的靈敏度和特異性(例)

表2 某一種國產(chǎn)ELISA試劑盒的靈敏度和特異性(例)

3 討論

RV為披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的惟一成員，其核酸是一單正鏈40s的RNA?；蚪M包含3個UTR和2個長且不重疊的ORF，3′- 端的ORF轉(zhuǎn)錄24 s mRNA，后者翻譯成多聚蛋白前體p110，經(jīng)宿主細胞的蛋白酶水解加工，形成膜表面蛋白E1、E2和衣殼蛋白C。其中E1蛋白是主要的膜蛋白，含有主要的抗原表位[9]，激發(fā)體液免疫和細胞免疫反應(yīng)的抗原性最強[6]；在第76、177、209位包含三個N- 聯(lián)糖基化位點，對維持E1蛋白固有的折疊、構(gòu)象穩(wěn)定以及抗原表位在E1上正確表達起重要作用。

RV的檢測方法有：病毒分離、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)檢測等技術(shù)[1]。病毒分離培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但在疾病早期陽性率低、周期長，只適用于病原學(xué)研究；分子生物學(xué)檢測快速、靈敏，但成本高易污染不適合臨床篩查；血清學(xué)診斷方法適用于RV感染的實驗室診斷和大規(guī)模臨床調(diào)查[10]，其技術(shù)主要有：ELISA、免疫熒光分析[11]和化學(xué)發(fā)光免疫分析[12-13]等。國內(nèi)RV抗體篩查主要通過ELISA方法[14]檢測血清中RV的IgM、IgG抗體。國產(chǎn)試劑品牌較多，結(jié)果差異較大，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；進口試劑雖然靈敏度高、特異性強，但價格昂貴。隨著對RV蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)特性的深入研究和分析，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，根據(jù)研究者的意愿在基因水平上切割、拼接和修飾，重組表達RV特異性抗原，這樣既可保留天然抗原的特異性和主要生物學(xué)活性，又可去除或減少非特異性反應(yīng)，提高ELISA檢測RV抗體的特異性[15]。Nedeljkovic et al[16]研究發(fā)現(xiàn)E1糖蛋白在病毒感染細胞時引發(fā)免疫反應(yīng)和強烈的抗體親和力成熟；Bosma et al[6]和Starkey et al[7]分析發(fā)現(xiàn)E1蛋白上195～296 aa區(qū)域是E1蛋白的主要抗原區(qū)域，其相應(yīng)核苷酸序列高度保守。提示E1蛋白的此特異片段可作為特異診斷抗原用于RV抗體檢測。目前對RV診斷抗原的研究普遍存在兩方面的問題：① 大多采用原核表達體系[15]，生成的E1蛋白抗原均以包涵體的形式存在，不能對表達蛋白進行有效的翻譯后修飾，生物學(xué)特性與天然蛋白存在較大差異，檢出率和特異性都比較低，同時存在復(fù)性困難，不易純化和難以大規(guī)模生產(chǎn)；② 用真核系統(tǒng)表達的RV蛋白，多為對E1蛋白片段的完整表達，抗原活性更接近天然蛋白，但完整E1蛋白上帶有許多非抗原表位，用于臨床檢測或疫苗時會帶來非特異性反應(yīng)。

由于原核表達系統(tǒng)及完整病毒基因真核表達存在以上問題，本實驗將RV的E1蛋白的195～296 aa對應(yīng)的優(yōu)勢序列進行全序列基因合成，并在真核系統(tǒng)表達，成功獲得了高質(zhì)量的重組E1蛋白，抗原性好。將重組表達的E1蛋白作為包被抗原建立RV- IgM抗體間接ELISA檢測方法，并與索林公司的化學(xué)發(fā)光試劑和某種國產(chǎn)ELISA試劑同時檢測血清標(biāo)本。索林化學(xué)發(fā)光試劑作為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計算重組RV抗原、國產(chǎn)試劑檢測的特異度和靈敏度，χ2檢驗結(jié)果顯示，與國產(chǎn)試劑比較，重組RV 抗原試劑具有較高的靈敏度和較強的特異性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本實驗所獲得的重組抗原與原核表達及完整病毒基因真核表達重組抗原相比有著明顯的優(yōu)勢，其特異性和敏感性相對較高，而且此法操作簡單、方便、成本較低，有利于市場開發(fā)。

本研究基因工程全合成的E1優(yōu)勢抗原表位在酵母中可以高表達，獲得的高純度E1蛋白的抗原性和特異性比較強，利用其建立的IgM間接ELISA方法，其敏感性和特異性相對較高，可開發(fā)試劑盒用于檢測風(fēng)疹病毒的早期感染。

表3 自建重組RV蛋白抗原 ELISA試劑盒和某一種國產(chǎn) ELISA試劑盒靈敏度和特異性比較(例)