顧亞男，周 宏，朱婷婷，李名聰，羅 欣，張勝權(quán)

甲羥戊酸(mevalonic acid,MVA)代謝途徑是細胞生長過程中重要的代謝途徑，其中間產(chǎn)物與終產(chǎn)物包括MVA、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)、香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate， GGPP)和膽固醇(cholesterol,CH)等[1]。此代謝途徑產(chǎn)生的FPP和GGPP可以為小G蛋白的脂化過程提供異戊烯基，從而參與蛋白活化過程，以此來影響細胞代謝途徑(尤其是對Ras超家族)[2]；此外，CH是細胞內(nèi)膜的組成成分，也可轉(zhuǎn)化成生物活性物質(zhì)[3-4]。研究[5]表明，MVA代謝途徑中的代謝產(chǎn)物會影響細胞的增殖、分化與凋亡。

MVA代謝途徑中一些酶的特異性抑制劑，如：3- 羥基3- 甲基戊二酸輔酶A(3- Hydroxy- 3- Methylglutary CoA，HMGCoA)還原酶抑制劑、他汀類及胺丁羥磷酸鹽(alendronate, ALD)等能通過改變細胞周期相關蛋白的表達來對皮膚角質(zhì)形成細胞(keratinocytes，KCs)增殖產(chǎn)生抑制作用[6]。此外，當編碼MVA途徑的基因純合突變時，由于突變位點的不同從而酶活性缺失程度不同[7]。2012年Zhang et al[8]研究表明甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)的雜合突變可導致播散型淺表性汗孔角化癥。以上表明了MVA途徑對皮膚的生長發(fā)育產(chǎn)生的重要影響，但對皮膚影響的可能機制尚不明確。因此，該實驗通過對KCs添加一種法尼基合成酶的抑制劑ALD來探討其對KCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑KCs細胞是由外科手術所得皮膚經(jīng)分離獲得；M154CF 培養(yǎng)基、膠原涂層基質(zhì)、中性蛋白酶、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素鏈霉素溶液、RIPA裂解液及細胞周期試劑盒購自上海碧云天生物公司；細胞活力測定實驗(MTS)試劑盒及抑制劑ALD、MVA、CH、FPP、 GGPP均購自美國sigma公司；細胞周期蛋白B1 (cell cycle protein B1, Cyclin B1)、Cyclin E及β- actin購自美國abcam公司；細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(cyclin- dependent protein kinase inhibitor, P21)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, pAKT)、磷酸化的胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2( phosphorylated extracellular signal- regulated kinase 1/2, pERK1/2)均購自美國Santa Cruz公司；所用二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 外科手術獲得無菌新鮮皮膚組織，無血清的培養(yǎng)基清洗數(shù)次以去除表面細菌。用已消過毒的鑷子和剪刀將皮膚組織剪成數(shù)個小塊，繼續(xù)用無血清的培養(yǎng)基沖洗多次后，放置于裝有無菌0.4%中性蛋白酶的離心管中，4 ℃消化過夜。第2天取出消化完全的皮膚組織，無菌鑷子撕下表皮，加入0.025%的胰蛋白酶消化3～5 min，然后置于200目細胞篩上，用無菌注射器鈍頭研磨，并用無菌無血清的培養(yǎng)基沖洗數(shù)次，將所得液體離心，用M154緩慢吹打形成KCs懸液，按一定比例接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。本實驗中所用藥物濃度為ALD 100 μmol/L、MVA 200 μmol/L、 CH 40 μmol/L、 FPP 5 μmol/L、 GGPP 1 μmol/L。

1.2.2細胞活力測定實驗(MTS) 0.025%胰酶消化收集KCs細胞接種于已鋪有膠原涂層的96孔板中，細胞懸液濃度調(diào)整為6×104/ml，每孔100 μl，待細胞達到一定覆蓋率時(70%～80%)，按以下處理方式：ALD、ALD+MVA、ALD+CH、MVA、CH、ALD+FPP、ALD+GGPP、FPP、GGPP加入相應藥物(藥物濃度參見1.2.1細胞培養(yǎng))；并設置空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，每孔加20 μl MTS試劑后，混勻，在細胞培養(yǎng)箱里孵育2～4 h后使用酶標儀檢測其490 nm處的吸光度(optical delnsity,OD)值，實驗重復3次。

1.2.3細胞周期檢測 0.025%胰酶消化收集KC細胞接種于已鋪有膠原涂層的6孔板中，每孔細胞數(shù)為5×104，在孵箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞密度達到70%～80%時，分為藥物單獨作用組(藥物濃度參見1.2.1細胞培養(yǎng))：ALD、MVA、CH、FPP、GGPP；聯(lián)合作用組：ALD+MVA、ALD+CH、ALD+FPP、ALD+GGPP；并設置空白對照組作用2 d后，用0.025%胰酶消化后收集KCs細胞，按照細胞周期試劑盒的說明書操作后，室溫下避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，F(xiàn)lowjo軟件分析細胞周期，實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測蛋白P21、Cyclin B1和Cyclin E的表達 用0.025%胰酶消化收集KCs細胞接種于已鋪有膠原涂層的24孔板中，每孔細胞數(shù)為2×105，待細胞達到70%～80%匯合度時，分為藥物單獨作用組(藥物濃度參見1.2.1細胞培養(yǎng))：ALD、MVA、CH、FPP、GGPP；聯(lián)合作用組：ALD+MVA、ALD+CH、ALD+FPP、ALD+GGPP；并設置空白對照組作用2 d后，提取細胞總蛋白，進行SDS- PAGE凝膠電泳，按10 μl/孔上樣量加入適當濃度的膠中，然后進行電泳(濃縮膠60 V，40 min；分離膠120 V，1 h)、轉(zhuǎn)移(恒流300 mA，1.5 h)、封閉(5%脫脂牛奶封閉2 h)、孵育一抗(4 ℃，過夜)、孵育二抗(常溫搖床孵育2 h)，洗膜后用Thermo SuperSignal West Pico Trial Kit化學發(fā)光底物顯影，分析各蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 CH能部分補救ALD對KCs增殖抑制效應ALD(100 μmol/L)單獨處理KCs細胞時，其顯著抑制KCs的增殖，抑制率為50%，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；當給ALD分別補充MVA、CH、FPP、GGPP時，僅CH有部分補救ALD對KCs增殖抑制的影響，與只加ALD組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而MVA可協(xié)同ALD對KCs增殖的抑制效應。見圖1。

圖1 ALD單獨或聯(lián)合MVA、CH、FPP、GGPP對KCs增殖抑制作用

2.2 CH能調(diào)節(jié)ALD對KCs細胞周期G1期的阻滯效應ALD單獨作用于KCs時，可造成細胞G1期阻滯；當補充MVA、CH、FPP、GGPP進行處理時，僅CH能夠部分補救ALD引起的G1期阻滯，F(xiàn)PP、GGPP單獨處理KCs時均能造成細胞G1期阻滯，并且FPP能協(xié)同ALD的G1期阻滯，與只加ALD組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=55.913，P<0.05)。見圖2。

2.3 ALD單獨或聯(lián)合MVA、CH、FPP、GGPP處理KCs對Cyclin B1、Cyclin E和P21表達的影響ALD單獨處理KCs后，與空白對照組比較，ALD顯著下調(diào)Cyclin B1、上調(diào)P21、Cyclin E的表達(P<0.01)；聯(lián)合補充MVA、CH后，均能協(xié)同ALD，從而上調(diào)P21的表達[ALD與MVA交互作用(F=45.105，P<0.01)，ALD與CH交互作用(F=106.525，P<0.01)]，拮抗ALD對Cyclin B1的下調(diào)[ALD與MVA交互作用(F=352.476，P<0.01)]，ALD與CH交互作用(F=163.661，P<0.01)，拮抗ALD下調(diào)Cyclin E的表達[ALD與MVA交互作用(F=34.896，P<0.01)，ALD與CH交互作用(F=64.070，P<0.01)]，與ALD組比較，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖3A、3B。聯(lián)合補充FPP后，可協(xié)同ALD下調(diào)Cyclin B1的表達[ALD與FPP交互作用(F=23.924，P<0.01)]，拮抗ALD上調(diào)Cyclin E[ALD與FPP交互作用(F=8.930，P<0.01)]，P21的表達[ALD與FPP交互作用(F=62.505，P<0.01)]，與ALD組相比，均有統(tǒng)計學意義；當補充GGPP時，能協(xié)同ALD上調(diào)Cyclin E的表達[ALD與GGPP交互作用(F=6.291，P<0.01)]，與ALD組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。見圖3C、3D。

圖2 流式細胞術檢測細胞周期

A：ALD單獨或聯(lián)合MVA、FPP對KCs細胞周期的影響；B：ALD單獨或聯(lián)合GGPP、CH對KCs細胞周期的影響；與空白對照組比較：**P<0.01；與只加ALD組比較：##P<0.01

圖3 ALD單獨或聯(lián)合用藥對KCs細胞周期蛋白表達的影響

A：ALD單獨或聯(lián)合MVA、CH對KCs細胞周期蛋白的影響；C：ALD單獨或聯(lián)合FPP、GGPP對KCs細胞周期蛋白的影響；B、D：蛋白表達的灰度分析；與空白對照組比較：**P<0.01；與只加ALD組比較：##P<0.01

圖4 ALD單獨或聯(lián)合用藥對KCs信號途徑相關蛋白表達的影響

A：ALD單獨或聯(lián)合MVA、CH對KCs 信號途徑相關蛋白的影響；C：ALD單獨或聯(lián)合FPP、GGPP對KCs信號途徑相關蛋白的影響；B、D：蛋白表達的灰度分析；與空白對照組比較：**P<0.01；與只加ALD組比較：##P<0.01

2.4 ALD單獨或聯(lián)合MVA、CH、FPP、GGPP處理KCs對PERK1/2、PAKT表達的影響ALD單獨處理KCs時，顯著上調(diào)PAKT的表達量(F=33.564，P<0.01)，下調(diào)PERK1/2的表達(F=394.753，P<0.01)，與空白對照比較差異有統(tǒng)計學意義；當給ALD處理組聯(lián)合補充MVA、CH、FPP、GGPP時，MVA可拮抗ALD的PERK1/2下調(diào)，與ALD組比較，差異均有統(tǒng)計學意義[ALD與MVA交互作用(F=32.413，P<0.01)]，見圖4A、4B。而CH、FPP、GGPP均拮抗PAKT的上調(diào)[ALD與CH交互作用(F=95.622，P<0.01)；ALD與FPP交互作用(F=136.283，P<0.01)；ALD與GGPP交互作用(F=699.076，P<0.01)]及PERK1/2的下調(diào)[ALD與CH交互作用(F=47.359，P<0.01)；ALD與FPP交互作用(F=139.892，P<0.01)；ALD與GGPP交互作用(F=284.511，P<0.01)]，與ALD組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。ALD與MVA、CH單獨或聯(lián)合補充對PAKT、PERK1/2表達的影響見圖4A、4B；ALD與FPP、GGPP單獨或聯(lián)合補充對PAKT、PERK1/2表達的影響見圖4C、4D。

3 討論

皮膚是由表皮構(gòu)成的機體最重要的器官之一，表皮是由皮膚KCs組成的，皮膚KCs能夠阻止皮膚的水分流失及保護皮膚不受體外細菌等微生物的侵襲。MVA途徑對機體來說是非常重要的一條代謝途徑，能夠?qū)毎鸬椒浅Ｖ匾淖饔?，其代謝中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物等可影響到細胞的增殖、分化與凋亡等[9]。

研究[10]表明ALD能損害上皮細胞的黏附，抑制人口腔黏膜細胞的分化與增殖。本研究中，ALD抑制 KCs的增殖，有可能是由于ALD對法尼基合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FDPS)的抑制，從而使上游產(chǎn)物MVA積累，下游產(chǎn)物FPP、GGPP、CH缺失；一般來說，上游產(chǎn)物MVA的積累有可能導致細胞MVA中毒，從而加強ALD對KCs的抑制，而下游產(chǎn)物FPP、GGPP的補充應當會減弱ALD的抑制，然而，補充下游產(chǎn)物FPP、GGPP，協(xié)同作用了ALD對KCs的抑制；僅CH減弱了ALD的抑制作用。ALD明顯降低Cyclin B1的表達，且不同程度上增強了Cyclin E、P21的表達，而CH可上調(diào)P21，拮抗ALD對Cyclin B1和Cyclin E的表達。研究[11-12]表明高表達的Cyclin E會出現(xiàn)在G1期，而Cyclin B1調(diào)控細胞從G2到M期，P21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，抑制細胞周期從G1期到S期，從而使其阻滯在G1期。因此，CH通過拮抗ALD對 Cyclin B1的表達，從而減弱ALD對細胞周期的阻滯作用。除此之外，本研究還探討了絲裂原激活蛋白激酶(mitogen- activated protein kinases，MAPK)及磷脂酰基酶3- 激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3- kinase- protein kinase B，PI3K- AKT)代謝途徑對KCs細胞增殖產(chǎn)生的影響，以上兩種代謝途徑對KCs增殖的影響很復雜，表明了KCs的增殖不僅與以上兩條代謝途徑相關，更是多種代謝途徑共同作用的復雜結(jié)果，有待繼續(xù)探討。

綜上，ALD抑制KCs增殖，CH可部分減弱ALD對KCs增殖的抑制作用。結(jié)果表明CH的缺失有可能會形成某些與MVA代謝途徑相關的皮膚方面的疾病，同樣，CH也為某些MVA代謝途徑相關的皮膚方面的疾病提供了治療的新思路。然而，本實驗僅局限于體外細胞研究，下一步可以此為基礎，構(gòu)建MVA代謝途徑相關基因的小鼠模型，從體外轉(zhuǎn)移到體內(nèi)來研究MVA代謝途徑紊亂對皮膚表型的影響及其相關分子機制的研究。