陳容前,湯 雷,汪玉玲,劉均濤,陳 巖,楊如江

(滁州城市職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,安徽滁州 239000)

無(wú)論是平原還是高原缺氧暴露人群其患血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)都是增加的[1-2],缺氧會(huì)增強(qiáng)血小板的反應(yīng)性,促進(jìn)血小板聚集及血栓形成[3]。近年來(lái),盡管缺氧暴露的人群越來(lái)越多,但人們似乎仍缺乏對(duì)缺氧相關(guān)血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)的防范意識(shí)[4],因此,積極干預(yù)缺氧暴露風(fēng)險(xiǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前,抗氧化干預(yù)可通過(guò)調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)基因而發(fā)揮抗缺氧保護(hù)作用[5],抗氧化劑的攝入可提高機(jī)體缺氧耐受力[6]。滁菊多糖能提高小鼠缺氧耐受力的結(jié)果已經(jīng)被證實(shí),但滁菊多糖的耐缺氧保護(hù)作用是否與抗凝有關(guān)仍未知[7]。有報(bào)道稱,滁菊對(duì)血流動(dòng)力學(xué)具有改善功能[8],滁菊總黃酮?jiǎng)t對(duì)心肌梗死小鼠心臟具有保護(hù)作用[9],提示滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制可能涉及抗凝及降低血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)。為驗(yàn)證這一猜想,本研究將探討滁菊總提取物的耐缺氧保護(hù)功能與栓塞性死亡風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一種缺氧敏感基因,其與機(jī)體缺氧耐受潛能有關(guān)。有報(bào)道稱,生活在高原地區(qū)極耐缺氧的拉達(dá)克牛,其基因微陣列檢測(cè)結(jié)果顯示HIF-1是最活躍的上調(diào)基因之一,HIF-1及其調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和己糖激酶(hexokinase,HK2)在牛的高原耐氧適應(yīng)中扮演著重要角色[10-11],此外,HIF-1的基因上調(diào)對(duì)于高原缺氧暴露人群耐受力的提高是至關(guān)重要的,HIF-1信號(hào)抑制則在高原缺氧、水土不服發(fā)病機(jī)制中十分關(guān)鍵[12]。

脂蛋白a(lipoprotein a,Lp-a)是一種富含膽固醇的LDL樣顆粒,其與缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成和中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)[13]。流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究已確定,血清Lp-a水平升高是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,Lp-a可能通過(guò)促動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成機(jī)制來(lái)增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[14]。為降低血栓形成及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),Lp-a靶向療法應(yīng)運(yùn)而生[15]。

肌鈣蛋白是心肌損傷的高度敏感的生物標(biāo)志物,其水平升高被認(rèn)為是心肌梗塞診斷的基石[16]。血清肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)是心臟病患者全因和心血管死亡率的良好預(yù)測(cè)因子,同時(shí)也是急性缺血中風(fēng)死亡率的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[17]。

本研究將基于耐缺氧實(shí)驗(yàn)法建立小鼠氧氣剝奪模型,考察滁菊干預(yù)對(duì)各風(fēng)險(xiǎn)因素的影響,以明確滁菊在提高缺氧耐受及預(yù)防缺氧誘導(dǎo)的栓塞性疾病風(fēng)險(xiǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性ICR小鼠(20±2) g 南京市江寧區(qū)動(dòng)物繁殖場(chǎng);飼料及墊料 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司;鈉石灰 東莞永勝宏基醫(yī)療器械有限公司;無(wú)水乙醇(分析純) 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;滁菊 安徽菊泰滁菊草本科技有限公司;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH,D9132-5G) Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;parafilm封口膜 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠肌鈣蛋白T(TnT)Elisa試劑盒、小鼠脂蛋白a(Lp-a)Elisa試劑盒、小鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)Elisa試劑盒 南京金益柏生物科技有限公司。

BSM-220.4型電子分析天平 上海卓精電子科技有限公司;DYQC型醫(yī)用超聲波清洗器 連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司;帝肯sunrise梯度濾光片光吸收酶標(biāo)儀 帝肯上海貿(mào)易有限公司;SHB-3A循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠;離心機(jī) 無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠;砂芯過(guò)濾裝置 鹽城市鈺楊玻璃儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滁菊溶液制備 稱取1 g滁菊放入100 mL試管中,倒入70%乙醇40 mL,封口膜封好試管口后置于試管架上,放入超聲波清洗器,功率設(shè)為192 W、溫度為60 ℃,超聲波提取10 min,提取液抽濾后將得到的濾液倒入蒸發(fā)皿,隨后置于通風(fēng)櫥柜中的水浴鍋上70 ℃蒸發(fā)得到提取物。純凈水溶解后于50 mL容量瓶定容制得實(shí)驗(yàn)用提取液備用。采用DPPH自由基清除法[18]檢測(cè)提取物的抗氧化活力以控制每次提取液質(zhì)量,DPPH自由基清除率控制在87%。

1.2.2 滁菊對(duì)小鼠缺氧暴露的干預(yù) 將18只ICR雄性小鼠隨機(jī)分成2組,缺氧組和滁菊組,每組9只。缺氧組給予0.4 mL純凈水灌胃;滁菊組給予0.4 mL滁菊提取液(濃度為87%的DPPH自由基清除率)灌胃。預(yù)處理1 h后,將所有小鼠分別放入盛有200 g鈉石灰的500 mL廣口瓶中,蓋實(shí)瓶蓋后用封口膜密封缺氧處理30 min后使小鼠迅速脫離缺氧環(huán)境,第2 d、第3 d再重復(fù)兩次,末次缺氧30 min后將小鼠取出,迅速眼球摘除法取血。具體實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

圖1 滁菊干預(yù)缺氧暴露小鼠流程Fig.1 Protocol of pretreatment with Chuju in mice exposed to hypoxia

1.2.3 耐受鼠及敏感模型鼠建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分組,動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為:溫度(21±2) ℃,濕度(30%～70%),光照周期12 h/12 h,動(dòng)物自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)期間,將選定的18只ICR雄性小鼠直接置于盛有鈉石灰的廣口瓶中,封口后立即記時(shí),直至小鼠出現(xiàn)缺氧抽搐癥狀,迅速取出小鼠使其脫離缺氧環(huán)境,并記錄每只小鼠的抽搐時(shí)間。根據(jù)抽搐時(shí)間,將小鼠分成缺氧敏感組(30 min以下)、中度敏感組(30～40 min)、耐受組(40 min以上)。其中,缺氧敏感組及耐受組小鼠在初次缺氧暴露后24 h、48 h再進(jìn)行缺氧暴露2次,每次持續(xù)時(shí)間為25 min,末次缺氧后將所有小鼠取出眼球摘除法采血備用。

1.2.4 Elisa法檢測(cè)血清HIF-1、Lp-a及TnT的含量

1.2.4.1 血清的制備 眼球摘除法采血后,置于10 mL離心管中,室溫血液自然凝固10～20 min后,離心機(jī)3000 r/min下離心20 min。仔細(xì)收集上清置于EP管中并標(biāo)簽后,-20 ℃保存?zhèn)溆谩１４孢^(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

1.2.4.2 Elisa法實(shí)驗(yàn)操作 按小鼠HIF-1、Lp-a及TnT Elisa分析(enzyme linked immunoassay)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度(OD值),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及樣本的OD值計(jì)算各樣品的實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

統(tǒng)計(jì)結(jié)果均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)來(lái)表示,運(yùn)用SPSS 22.0 for windows軟件進(jìn)行One-way ANOVA:LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較,以p<0.05判定有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有作圖均由Origin 8.0軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1、Lp-a及TnT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)(X),濃度為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行曲線擬合。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見(jiàn)圖2,各回歸方程的R2均在0.98以上,表明OD值與各指標(biāo)濃度間存在顯著的線性關(guān)系,即標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果可靠。

圖2 HIF-1、Lp-a及TnT標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of HIF-1,Lp-a and TnT

2.2 滁菊干預(yù)對(duì)缺氧鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT的影響

耐缺氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)滁菊可提高小鼠的缺氧耐受力[7],而HIF-1為缺氧耐受因子,為明確滁菊活性成分是否通過(guò)HIF-1提高缺氧鼠的缺氧耐受力,圖3A顯示了滁菊干預(yù)對(duì)缺氧小鼠血清HIF-1表達(dá)水平的影響。與單獨(dú)缺氧暴露小鼠相比,缺氧前給予滁菊干預(yù)能極顯著地提高HIF-1的表達(dá)水平(p<0.01),表明滁菊可促進(jìn)缺氧狀態(tài)下小鼠HIF-1的表達(dá)。

Lp-a及TnT是血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子,為明確滁菊是否可抑制缺氧誘導(dǎo)的血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn),圖3B、3C比較了缺氧暴露小鼠與滁菊干預(yù)小鼠之間血清Lp-a、TnT表達(dá)水平的差異。滁菊干預(yù)能顯著地抑制缺氧鼠Lp-a及TnT的表達(dá)(p<0.05),表明滁菊可抑制缺氧誘導(dǎo)的血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)。

圖3 滁菊干預(yù)對(duì)缺氧暴露小鼠血清 HIF-1、Lp-a、TnT的影響(n=3)Fig.3 Effect of Chuju intervention on serum HIF-1,Lp-a, TnT in mice exposed to hypoxia(n=3)注:*代表差異顯著,p<0.05;**代表 差異極顯著,p<0.01,圖4同。

2.3 缺氧耐受小鼠及缺氧敏感小鼠血清HIF-1、Lp-a、TnT表達(dá)差異

為明確滁菊對(duì)缺氧鼠HIF-1的上調(diào)是否發(fā)揮了抗缺氧保護(hù)功效,圖4A比較了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中HIF-1表達(dá)水平差異。與缺氧敏感組小鼠相比,缺氧耐受組小鼠血清中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)顯著增加(p<0.05),這與缺氧耐受動(dòng)物HIF-1水平升高結(jié)果一致[9]。表明血清HIF-1表達(dá)水平升高有助于促進(jìn)小鼠的缺氧耐受力,HIF-1上調(diào)介導(dǎo)了滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制。

為明確滁菊對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)因子表達(dá)抑制是否參與了其抗缺氧保護(hù)機(jī)制,圖4B、4C比較了缺氧敏感鼠及耐受鼠血清中Lp-a、TnT表達(dá)水平的差異。與缺氧敏感組小鼠相比,缺氧耐受組小鼠血清中Lp-a雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),但TnT表達(dá)水平則極顯著降低(p<0.01),表明TnT為缺氧敏感因子,其表達(dá)下調(diào)有利于提高缺氧耐受力。因此,TnT的表達(dá)抑制參與了滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制。

圖4 缺氧耐受組、敏感組小鼠血清中 HIF-1、Lp-a、TnT水平差異(n=3)Fig.4 Differences in serum levels of HIF-1, Lp-a,TnT between hypoxia-tolerant group and sensitive group(n=3)

3 討論

HIF-1是一種缺氧應(yīng)答因子,其本質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)可啟動(dòng)下游一系列抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá),從而促進(jìn)缺氧適應(yīng)[11,19]。圖3A結(jié)果顯示,與缺氧對(duì)照組相比,滁菊干預(yù)能極顯著促進(jìn)HIF-1的表達(dá)(p<0.01),提示HIF-1可能參與了滁菊的缺氧保護(hù)機(jī)制。與缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠的血清HIF-1水平顯著增加(p<0.05)(圖4A),這與缺氧耐受動(dòng)物HIF-1水平升高的報(bào)道結(jié)果一致[10],說(shuō)明HIF-1有利于缺氧動(dòng)物耐受力的提高,滁菊可通過(guò)促進(jìn)HIF-1表達(dá)而提高小鼠缺氧耐受力,即HIF-1的上調(diào)介導(dǎo)了滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制。

高原缺氧暴露人群中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)是增加的,尤其是缺血性中風(fēng)最常見(jiàn)[2],隨著高原缺氧暴露人群越來(lái)越多,研究高原中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的意義。臨床研究表明,血清Lp-a水平升高是腦中風(fēng)獨(dú)立的死亡風(fēng)險(xiǎn)因子,Lp-a是心血管疾病的重要靶點(diǎn)[15]。滁菊干預(yù)能顯著抑制缺氧導(dǎo)致的Lp-a水平的升高(p<0.05)(圖3B),然而,通過(guò)比較缺氧耐受鼠與缺氧敏感鼠之間Lp-a水平差異并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(圖4B)。以上結(jié)果表明,小鼠無(wú)法通過(guò)自身潛能抑制Lp-a的表達(dá),即缺氧累積損傷超出了小鼠自身的生理調(diào)節(jié)能力,而滁菊干預(yù)提供了外源性保護(hù)作用。此外,發(fā)現(xiàn)Lp-a在缺氧耐受或缺氧敏感鼠中的表達(dá)水平極顯著地高于缺氧組,這可能是因?yàn)榍皟山M的缺氧模式風(fēng)險(xiǎn)更大,提示選擇Lp-a作為缺氧死亡風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)是合理的。

TnT 是缺血性中風(fēng)病人另一獨(dú)立的死亡風(fēng)險(xiǎn)因子[17]。與缺氧對(duì)照組相比,滁菊預(yù)處理能顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的TnT表達(dá)(p<0.05)(圖3C),說(shuō)明滁菊在預(yù)防缺氧相關(guān)血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)上具有一定的潛力。與缺氧敏感鼠相比,缺氧耐受鼠血清中TnT水平明顯減少(圖4C),表明TnT表達(dá)阻抑對(duì)提高小鼠的缺氧耐受力是有利的,滁菊對(duì)TnT的下調(diào)參與了滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制。

綜上所述,在預(yù)測(cè)缺氧相關(guān)死亡及血栓性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)方面,TnT是比Lp-a更敏感的預(yù)測(cè)因子。TnT及HIF-1共同參與了滁菊的耐缺氧保護(hù)機(jī)制,即滁菊具有提高小鼠缺氧耐受及預(yù)防缺氧相關(guān)血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)的雙重保護(hù)作用,這將為滁菊用以預(yù)防高原缺氧導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病提供理論依據(jù)。