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        簡述桶裝水中銅綠假單胞菌的幾種檢測方法

        2019-09-10 07:22:44馬慧娟徐慧高宏
        食品安全導(dǎo)刊·中旬刊 2019年3期
        關(guān)鍵詞:銅綠濾膜底物

        馬慧娟 徐慧 高宏

        引言

        銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),也稱為綠膿桿菌,屬于假單胞菌屬。廣泛分布于自然界(土壤、空氣、水源等)及正常人皮膚、腸道和呼吸道,大小為(1.5~3.0)μm×(0.5~0.8)μm,屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌。該菌在普通培養(yǎng)基上生長良好,專性需氧,菌落形態(tài)不一,多數(shù)直徑在 2~3 mm,邊緣不整齊,扁平濕潤。在血瓊脂平板上形成透明溶血環(huán)。銅綠假單胞菌是一種重要的水源性致病菌,廣泛存在于各類型水中,對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力,可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。

        目前檢測銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)中采用的主要是傳統(tǒng)生化方法,包括分離培養(yǎng)、生化鑒定等,不能實現(xiàn)大批量水樣的快速檢測。近幾年,隨著科技的發(fā)展,檢測銅綠假單胞菌的方法多種多樣,本文對近年銅綠假單胞菌檢測技術(shù)進(jìn)行綜述,為銅綠假單胞菌的快速、準(zhǔn)確檢測研究技術(shù)提供參考。

        銅綠假單胞菌檢測技術(shù)

        國標(biāo)濾膜法

        檢測桶裝水中銅綠假單胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》。銅綠假單胞菌產(chǎn)色素分為三種:產(chǎn)綠膿菌素,產(chǎn)青膿素,產(chǎn)紅膿素;銅綠假單胞菌在4℃不生長而在42℃可以生長;具有氧化酶,可以使細(xì)胞色素C氧化,再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化,生成有色的醌類化合物:可以產(chǎn)生一種脫酰胺酶,可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨,滴加納氏試劑(碘化汞鉀),氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用,生成紅色絡(luò)合物;根據(jù)這些生化特性,通過濾膜過濾將銅綠假單胞菌富集到CN瓊脂上,再用生化試劑管進(jìn)行生化鑒定。也可以用VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)用于微生物鑒定,準(zhǔn)確率高,可用于微生物實驗室的日常檢測工作。

        實時熒光定量PCR檢測

        外毒素 A 基因在銅綠假單胞菌中高度保守,根據(jù) GenBank 中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列,設(shè)計特異性引物及TaqMan探針,并利用實時熒光 PCR技術(shù),對目標(biāo)靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增,建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法,特異性試驗和靈敏性試驗良好,該檢測方法具有特異、快速的特點(diǎn),能夠滿足檢測要求,為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

        LAMP檢測

        環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(以下簡稱LAMP):利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng),40min內(nèi)可完成核酸擴(kuò)增,檢測過程不需要昂貴的儀器設(shè)備,簡單的水浴鍋即可,擴(kuò)增產(chǎn)物不需要繁瑣的電泳過程,快速靈敏,特異性強(qiáng),成本低,尤其適合大量、即時、現(xiàn)場的病原微生物的初篩,易于在基層推廣應(yīng)用。

        酶底物法

        酶底物法(Pseudalert)采用特異性固定底物技術(shù),目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生能夠分解 Pseudalert 底物特定的酶,產(chǎn)生熒光,在24 h內(nèi)即可得到結(jié)果,無需進(jìn)行驗證試驗,該方法能夠較好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)濾膜法在檢測工作中的不足,在美國和歐洲部分地區(qū)已經(jīng)被批準(zhǔn)為檢驗銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。

        結(jié)論與展望

        近年來瓶、桶裝水監(jiān)測發(fā)現(xiàn)各種污染物如銅綠假單胞菌等污染問題逐漸增多,因瓶、桶裝水中污染物如銅綠假單胞菌污染引起的食物中毒也時有發(fā)生,成為公共衛(wèi)生的重大隱患。國標(biāo)方法作為一種傳統(tǒng)、經(jīng)典的檢測方法,與實時熒光定量PCR方法、LAMP方法、酶底物法一起成為食品安全檢測的重要工具。傳統(tǒng)方法假陽性率低,但檢測周期長。隨著技術(shù)研究的不斷深入,希望核酸方法、酶底物法能夠進(jìn)一步優(yōu)化和完善,實現(xiàn)快速、特異、靈敏、高通量,可廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、檢驗檢疫、衛(wèi)生防疫、疾病診斷等領(lǐng)域,前景非常廣闊。

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